徕卡 TCS SP8 STED 超高分辨共聚焦显微镜快速操作手册
Leica TCS SP8 STED Super-Resolution Confocal Microscope - Quick Operation Guide 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司，2015年11月 24小时服务热线：400-820-8932
一、系统组成
Leica TCS SP8 STED 是一套集成了 STED（受激发射损耗）超高分辨技术的激光共聚焦显微镜系统。
1.1 核心硬件组件
| 组件 | 说明 |
|---|---|
| 研究级倒置显微镜 | DMI6000 或 DMi8 两种选择 |
| 共聚焦扫描头 | 激光扫描主体 |
| 白激光（White Laser） | 可选，紧凑型 / 灵活型两种 |
| STED 激光及控制箱 | 可选 592nm / 660nm / 775nm 等波长 |
| 普通激光光源控制箱 | 常规激光线 |
| 荧光激发光源 | 宽场荧光观察用 |
| HyD 检测器 | 高灵敏度混合检测器（可选） |
| 显微镜控制器 | 硬件控制单元 |
| 控制面板 + 遥控手轮 | 手动操作界面 |
| 电脑主机 + 显示器 | LAS X 软件运行平台 |
| 防振台 | 隔振平台 |
1.2 软件平台
- LAS X：徕卡共聚焦操作软件
- Huygens：整合的反卷积处理软件
- 四大功能模块：Configuration（配置）、Acquire（采图）、Process（处理）、Quantify（定量）
二、开机流程
2.1 两种光源配置的开机差异
| 步骤 | FSU 系统（灵活型） | CSU 系统（紧凑型） |
|---|---|---|
| 1 | 打开 PC Microscope 按钮 | 启动电脑主机 |
| 2 | 打开 Scanner Power 按钮 | 打开显微镜控制器 |
| 3 | 打开 Laser Power 按钮 | 打开 Scanner Power 按钮 |
| 4 | Laser Emission 钥匙旋至 On-1 | 打开 Laser Power 按钮 |
| 5 | — | Laser Emission 钥匙旋至 On-1 |
注意：显微镜控制器开关一般常开，打开 PC Microscope 后指示灯应点亮。
2.2 后续通用步骤
- 打开白激光（如有配备）：部分系统白激光串联在 Laser Power 后自动打开，未串联的需单独将钥匙旋至 On
- 打开 STED 激光：
- 592nm：按黑色按钮开电源 → SHG READY 变绿 → 钥匙旋至 laser on
- 775nm：后方电源开关 → 前面板钥匙旋至 on
- 部分系统 STED 激光也串联在 Laser Power 后自动打开
- 打开荧光激发光源：按绿色 Power 按钮
- 启动 LAS X 软件：双击桌面图标
- 配置选择：
- Configuration 下拉选择配置（simulator 为模拟模式，不控制硬件）
- Microscope 选择显微镜型号
- STED 选项设为 On
- Resonant 快扫功能（如有）按需开启
- 激光配置：Configuration → Laser Config → 打开所需激光（OFF→ON），调节输出功率
- STED 模式激活：
- 需先切换到 100X STED 专用物镜（否则按钮为灰色）
- 点击 STED 模式按钮激活
- STED 校准（每次开机一次）：
- 切换到 100 倍物镜
- 开启 592 STED 激光 + 至少一条普通激光
- Configuration/STED → 点击 “Align Beams” 自动校准
- 校准完成显示 “Alignment successful!”
- 失败可调用 STED Depletion Alignment 设置重试
三、软件界面
| 区域 | 功能 |
|---|---|
| 顶部功能切换 | Configuration / Acquire / Process / Quantify |
| 工具/文件管理 | Project（当前图片） / Acquisition（功能按钮和参数） |
| 拍摄参数区 | Format（像素）、Speed（速度）、Zoom factor（放大）、Average（平均）、Pinhole（针孔） |
| 三维扫描工具组 | Z 轴范围设定及辅助设置 |
| 光路显示区 | 激发→检测光路直观显示 |
| 图像显示窗口 | 实时预览和结果显示 |
| 控制栏 | 预设光路、STED 激光控制、白激光控制、物镜选择、预览/拍摄按钮 |
四、显微镜下样品观察（DMi8）
4.1 物镜选择
- 触摸屏电动主机：触摸屏界面选择，干/油镜之间切换需点击两次
4.2 明场观察
- 按钮操作：左侧 TL/Fluor 按钮切换明场（TL 黄灯亮）→ 打开照明光源 → 亮度调节旋钮
- 触摸屏操作：BF 按钮 → TL-Shutter 打开照明
- 选择视野：调焦按钮/旋钮调 z 平面，电动载物台用遥控手轮
4.3 荧光观察
- 按钮操作：Fluor 黄灯亮时为荧光光路，开关及亮度调节同明场
- 触摸屏操作：FLUO 按钮 → TL-Shutter 打开激发光闸 → FLUO-Filtercubes 切换滤块
- 注意：观察完毕及时关闭荧光光闸以保护样品
五、共聚焦图像采集
5.1 光路设置
调用预设光路
Load/Save single setting 下拉菜单选择预设（含常用荧光染料的完整参数），可修改后另存。
自由设置光路五要素
1. 激发光波长选择
- 参照荧光素激发光谱，选择最接近激发峰值的激光谱线
2. 检测范围设定
- 覆盖荧光素最大发射峰
- 检测波长 > 激发谱线至少 4~5nm
- 检测波长 < STED 谱线至少 10~15nm
- 如有更长波长荧光，应小于其发射范围
3. Sequential Scan（序列扫描）
- 染料发射光谱重叠时使用，减少串色
- 每次只用一种激发光，只检测一种染料
- STED 成像时也需启用：同一视野分别采集共聚焦和 STED 图像作对照
4. STED 激光选择
- STED 激光谱线应落在荧光素发射光谱尾部
- 发挥 Depletion（损耗）作用，实现超高分辨
- STED 激光功率越高，分辨率提升越明显
5. 门控检测（Gating）
- 共聚焦成像：除去反射光
- STED 成像：提高分辨率
- 前提条件：同时配有脉冲激光（如白激光）+ HyD 检测器
- 开始时间设 0.3ns 可去反射光 + 提高 STED 分辨率
- 设 1.0ns 可进一步提高 STED 分辨率
5.2 扫描模式
- 默认：xyz（可做 xy 扫描和 z 轴层切）
- 多维组合：xzy, xyt, xyλ, xyzt, xyzλ, xyzλt 等
5.3 扫描参数
| 参数 | 默认值 | 说明 |
|---|---|---|
| 分辨率 Format | 512×512 | 越高文件越大、采图越慢 |
| 扫描速度 Speed | 400Hz | 活细胞需更快；双向扫描 Bidirectional X 更快但需相位校准 |
| 针孔 Pinhole | 1 AU | 增大→信号强但共聚焦效果降低、光切厚度增加 |
| 线/面平均 Average | — | 降低噪点，可选平均次数 |
| 累加 Accumulation | — | 荧光极弱样品或 HyD Counting 模式 |
| 放大 Zoom | — | 像素点大小随 zoom 增加而减小 |
5.4 预览图像
- Live 按钮开始预览，Stop 停止
- 注意：预览时激光照射样品，应快速操作减少预览时间，STED 激光最好关闭
- 建议预览参数：512×512，600Hz，保证刷新频率
- 预览目的：找到最佳焦平面 + 图像亮度动态范围最佳化
亮度调节三要素
| 参数 | PMT 正常范围 | HyD 正常范围 | 调节原则 |
|---|---|---|---|
| Smart Gain | 500–1100 | 10%~500% | 增大→信号和噪音都增强 |
| Smart Offset | 经验值 -0.3 左右 | 不需要（背景噪声低） | 扣除背景噪音，越接近 0 越好 |
| 激光强度 | — | — | PMT gain > 800 或 HyD gain > 150% 仍不够时考虑增加；活细胞/多层成像尽量降低 |
动态范围判断（GlowOU 模式）
- LUT 按钮切换：伪彩 → Glow Over Under → 灰度图
- GlowOU 模式：饱和像素显示蓝色，灰度为 0 显示绿色
- 目标：少数像素呈蓝色（信号饱和），背景呈绿色（背景低）
5.5 采集图像
- 单通道/同时扫描多通道：Capture Image 按钮
- 序列扫描/多维扫描：Start 按钮
分辨率设置原则
- 普通共聚焦（Nyquist 采样）：像素大小 = 物镜侧向分辨率的 2/5~1/2
- STED 成像：像素大小 = 分辨率极限的 1/3 或更小
- 便捷操作：点击 Optimize xy Format 按钮，系统自动设置最佳分辨率
- 低倍物镜比高倍物镜需要更高扫描分辨率
六、图像反卷积处理（Huygens）
LAS X 整合了 Huygens 反卷积软件，可大幅降低噪点、提高信噪比。
6.1 操作流程
- 导出到 Huygens：Project 模块选中图像 → 右键 → Export / To Huygens Professional
- 检查参数：右键图像 → Parameter editor → 各通道检查：
- 普通共聚焦通道：Microscope type = confocal
- STED 通道：Microscope type = STED
- 脉冲激光 + 门控：STED depletion mode = Pulsed
- 非脉冲激光：选择 CW 选项
- 启动反卷积向导：右键 → Deconvolution wizard → Enter wizard
- 通道选择 → 下一步
- 背景值计算：接受推荐值或在背景处拉线确定 → 输入 Absolute background
- 反卷积参数：
- Maximum iterations：20~40（最大迭代次数）
- Quality threshold：0.01~0.0001（收敛阈值）
- 启动计算：点击 Deconvolution
- 逐通道处理：完成后 Accept to next channel
- 全部完成：All done
- 导回 LAS X：Huygens 右键 → Export / Autoscale to Leica
七、XYZ 三维扫描（Z-Stack）
7.1 Z 轴驱动方式
| 方式 | 说明 | 控制方式 |
|---|---|---|
| z-Wide | 显微镜固有 Z 轴（倒置镜升物镜，正置镜升载物台） | 调焦旋钮 + 遥控手轮 |
| z-Galvo | SuperZ 精细 Z 轴调节（选配） | 控制面板 Z Position 旋钮 |
7.2 设置步骤
- 设置光路参数
- 设置 Z 轴范围：
- Live 预览 → 调至起点 → 设起点
- 调至终点 → 设终点
- Stop 终止预览
- STED 3D 设置（如需 Z 轴超高分辨）：
- STED 激光控制栏设置 Z 轴分量
- PSF 示意图实时显示点扩散函数形状
- Z 轴参数：
- z-step size：层切间距
- Nr. of steps：层切数目
- system optimized：系统自动计算最优值
- 采图：Start 按钮
- 采图后：清除已设位置，避免影响下次
7.3 3D 展示方式
| 方式 | 功能 | 用途 |
|---|---|---|
| 最大亮度投影 Maximum projection | 所有 Z 平面取最亮点压缩成一层 | 显示跨层结构 |
| 正交剖面 Orthogonal section | XY/YZ/XZ 三方向显示指定位置剖面 | 3D 空间定位 |
| 3D 立体模式 3D viewer | 打开 3D 可视化模块 | 直观展示，可输出视频 |
八、时间序列扫描（xyt / Timeseries）
多用于活细胞成像，记录动态过程。
8.1 设置步骤
- Acquire → Acquisition → 选择 xyt 扫描模式
- 设置光路参数
- 定义 Time Interval（帧间隔），可选 Minimize（最小间隔）
- 采集停止条件：
- Acquire until stopped：手动终止
- Duration：总时长
- Frames：总帧数
- 选择分辨率和速度 → Start
九、HyD 检测器
Hybrid Detector，高性能混合检测器，比 PMT 更灵敏、响应更快。
9.1 三种操作模式
| 模式 | 原理 | 适用场景 |
|---|---|---|
| Standard 标准模式 | 信号直接显示，SmartGain 调亮度 | 常规成像，类似 PMT |
| Counting 光子计数模式 | 每个像素的光子数即亮度，Gain 固定 | 极弱荧光样品，需配合累加功能 |
| BrightR 模式 | 暗部分配更多动态范围 | 同时有极亮和较暗结构的样品 |
9.2 安全注意
- 信号过强保护机制：声音报警 → 自动关闭检测器 + 弹出提示
- 操作时：先降低激光功率、调低 SmartGain，再重新预览
- 两大禁忌：
- 激光功率从低开始慢慢增加，不要一开始设太高
- 不要用 HyD 检测反射光（反射光远强于荧光）
十、文件保存与输出
10.1 原始文件保存
- Save Experiment / Save Project：保存为 .lif 格式（徕卡原始格式）
- 需用 LAS X 或专业图像软件打开
10.2 图像输出
右键 → Export：
- 图片格式：.tiff / .jpeg
- 三维/多维：可输出视频（QuickTime / .avi / MPEG-4 / WMV 等）
- 可选择是否带标尺及位置
10.3 参数查看与恢复
- 右键 → Properties of…：查看所有采集参数
- Apply Settings：恢复该图像的参数设置
- Save as…：参数导出为 .xml 文件
十一、关机流程
- 保存已采集的图像
- Configuration → Laser Config → 关闭所有激光
- 关闭显微镜荧光电源
- 清洁油镜：用无水乙醚:无水乙醇 = 7:3 混合液，或无水乙醇清洁镜头
- 关闭 LAS X 软件
- 关闭 STED 激光开关 → 关闭 Laser Emission 钥匙
- 关闭 Scanner Power 按钮
- 在电脑上输出图像数据
- 关闭电脑 → 关闭 PC Microscope 按钮（CSU 系统关显微镜控制器）
- 如有氩离子激光器：等风扇停止（约 5 分钟）后再关 Laser Power；无氩离子可直接关
- 记录关机时间、仪器状况
十二、系统维护
| 项目 | 要求/规范 |
|---|---|
| 环境 | 室温 ~21℃，相对湿度 20-60%，保持清洁 |
| 激光器 | 严格遵守开、关流程 |
| 汞灯光源 | 开灯后等 10-15min 才能使用，20min 以上才能关闭 |
| 金属卤素灯 | 开灯后可直接使用，20min 以上才能关闭 |
| 载物台初始化 | Mark and Find / Tile Scan / Matrix 等精确定位功能需要，初始化时载物台四周不能有物品 |
| 物镜清洁 | 油镜用无水乙醇擦镜纸清洁；水镜用干擦镜纸吸干水渍 |
| 关机保护 | 转至低倍物镜并调至最低位，最大程度保护物镜 |
| 数据安全 | 优先光盘刻录，减少移动存储设备使用以防中毒 |
| 空调 | 避免空调直接对着显微镜吹风 |
| 拍摄环境 | 避免震动、环境光线、手机信号干扰 |
关联笔记
- 共聚焦项目-软件需求规格说明书-化学发光免疫分析仪（同项目需求文档）
- 共聚焦软件使用说明-功能模块手册（自研共聚焦软件功能说明）
- 共聚焦软件第一阶段计划-甘特图（项目计划）