Zeiss 710 共聚焦显微镜用户指南
康奈尔大学生物技术资源中心（BRC）成像设施编写的 Zeiss LSM 710 共聚焦显微镜用户操作手册。 位置：B46 Weill Hall，版本日期 2014-08-06。
一、开机与关机流程
开机（General Startup）
- 登录计算机（net id + 密码）
- 启动 Zen 软件
- 点击 Start System
- 选择物镜，按需添加浸没液
- 将样品放在载物台上
- 用明场或荧光聚焦样品
- 切换到 Confocal Acquisition
- 加载配置（Load configuration）
- 开始 Live Scan
关机（Ending Session）
- 检查预约时间表
- 保存图像
- 退出 Zen 软件
- 将文件传输到 Imaging Lab FileShare
- 注销 Windows
- 降低物镜，取出样品
- 擦去物镜上的油或水
完全关机（Total Shutdown）
- 除上述步骤外，还要关闭 Windows、盖上显微镜罩
- 非工作时间且下一位用户未到时，执行完全关机
- 有疑问时，选择完全关机
二、物镜配置
| 物镜 | 类型 | NA | 浸没方式 | 工作距离 | 色环 | 最小像素尺寸 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 10x | EC Plan-NEOFLUAR | 0.3 | 干镜 | 5.2 mm | 黄色 | 0.30 μm (300 nm) |
| 25x | LCI Plan-APOCHROMAT | 0.8 | 油/水多浸没 | 0.55 mm | 红/绿 | 0.10 μm (100 nm) |
| 40x | C-APOCHROMAT | 1.2 | 水浸没 | 0.28 mm | 蓝色 | 0.08 μm (80 nm) |
| 63x | Plan-APOCHROMAT | 1.4 | 油浸没 | 0.19 mm | 黑色 | 0.07 μm (70 nm) |
物镜切换
- 使用右侧调焦旋钮上的按钮切换物镜
- 25x 多浸没：红色标记=油，绿色/蓝色标记=水
- 40x 水浸没：滚花环设置盖玻片厚度（黑线对 0.17 = #1.5 盖玻片）
- 63x 油浸没：黑色环，纸质保护圈
三、载物台与调焦控制
载物台
- X-Y 操纵杆：顶部按钮在极慢/正常速度间切换（有蜂鸣声）
- 右侧调焦旋钮：调焦 + 快速调焦
调焦
- 手动调焦：两侧都有粗调和微调旋钮
- 远离=向上（左旋钮上方有箭头标识）
- 首次使用必须手动对焦
- 快速调焦（Quick Focus）：右调焦旋钮上的箭头按钮
- 放/取样品前务必用向下按钮降低物镜
- 向上按钮返回之前位置（手动找到焦点前不要用）
上样步骤
- 在物镜上滴油或水（10x 除外）
- 样品盖玻片朝下放在载物台上，用操纵杆居中
- 手动向上调焦，直到浸没液接触样品，再稍微降低但不脱离接触
- 通过目镜找到焦点
四、Zeiss 激光系统
激光线规格
| 激光 | 功率 | 用途 |
|---|---|---|
| 405 nm | 30 mW | DAPI 等蓝色染料，自动开启 |
| 488 nm（含 458/514 nm） | 25 mW | 绿色染料（GFP、FITC），需钥匙开启 |
| 561 nm | 15 mW | 红色染料（Rhodamine、dsRed） |
| 633 nm | 5 mW | AF647 等远红染料，自动开启 |
注意：488、514、458 nm 来自同一台氩离子激光器
五、Zen 软件操作
Locate（目镜定位模式）
- 选择明场（Bright Field）或荧光（Fluorescence）
- 荧光：打开所需灯（12% 功率起始），打开快门，选择滤光片
- 用目镜找到样品并聚焦
- 切换共聚焦前：按 Light Off 防止光漂白，点击 Acquisition
Acquisition（采集模式）
配置管理（Configurations）
- 必须打开文件夹并选择配置才能使用
- 或打开已有图像并点击 Reuse 复用设置
- 新建/修改配置用 Smart Setup
- 每次启动 Zen 都要重新加载配置（不会自动加载）
Smart Setup（智能设置）
- 推荐用 Smart Setup 而非手动添加染料（手动添加常失效）
- 选择染料和颜色，从最低波长开始
- 选择模式：Current（默认）
- 选择 Smartest (Line)（线序扫描）
- 点击 Apply
| Smart Setup 选项 | Autoscan | 帧尺寸 | 扫描速度 | 位深 | 扫描方向 | 针孔 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Current | 否 | 512×512 | 9 | 8 | 单向 | 1 AU |
| Quality | 是 | 1700×1700 | 6 | 12 | 单向 | 1 AU |
| Speed | 是 | 400×400 | 10 | 12 | 双向 | 1 AU |
| Standard | 是 | 512×512 | 9 | 8 | 单向 | 1 AU |
| Widefield Like | 是 | 512×512 | 9 | 8 | 单向 | Max |
推荐：用 Current（无 autoscan），手动设置参数
光路（Light Path）
- 可调整发射（光谱）区域
- **MBS（主分光器）**必须匹配使用的激光线
- 明场/DIC 图像点击 T-PMT（透射光探测器）
- 明场使用当前开启的激光作为光源，非独立灯
探测器（Detector ChS1）
- ChS1 通道可分成多个颜色通道（S1、S2 等）
- 只有一个 Master Gain
- 各 S 通道亮度用 Digital Gain 调节
实时扫描初始设置
| 参数 | 推荐值 | 说明 |
|---|---|---|
| 像素格式 | 512×512 或 1024×1024 | 点击 X*Y 更改 |
| 位深 | 12 bit（定量测量）/ 8 bit（普通成像） | 12 bit 动态范围更大 |
| 扫描方向 | 双向（Bi-directional） | 高分辨率时可能有伪影 |
| 激光功率 | 2% 起始 | 绿色染料从低功率开始 |
| 针孔 | 1 AU | 最佳光学切片厚度 |
| Master Gain | 500-750 | 信号放大器，不影响光漂白 |
| Digital Offset | 接近 0 | 背景黑电平 |
| Digital Gain | 1.0 | 4+ 色时分别调 S 通道 |
六、共聚焦扫描操作
扫描模式
- Live：快速连续扫描（预览用）
- Continuous：高质量连续扫描（较慢）
- Snap：拍单张图像
- Save Immediately：立即保存或打开新窗口
- Split：查看各颜色通道分离图
变焦（Zoom）
- Zoom-Crop Box：必须先停止扫描才能使用
- 将框定位到感兴趣区域
- 可调整大小、移动、旋转
- 点击 Live 查看变焦图像
- Live Zoom：实时扫描时可用
- 调整变焦值
- 可用图形/数值/滑块/箭头（最精确）调整
- Reset All 恢复 zoom=1 居中
- 可缩小到 0.6x，但边角会变暗
分辨率原则
- 在要分辨的最小物体上采集 2-3 个像素（Nyquist 采样）
- 不要小于最小像素尺寸
- 需要更小像素时换更高 NA 物镜
- 要小像素+大视场：用 1024×1024 或拼接（tiling）
图像保存
- 单张图像：Save Immediately 或打开新文档窗口
- Z 栈、时间序列、拼接等不会被覆盖，可稍后保存
- 保存格式：
.czi（Zeiss 原生格式）- 存储所有硬件设置
- 可从任何图像 Reuse 设置
- 保留完整元数据
- 保存路径：
D:\ALL USER IMAGES HERE - 传输到 Z: Imaging Lab FileShare（仅限康奈尔校园网访问）
.czi 文件打开方式
- Zen Lite 2012（免费，Blue / Black 版）
- Zen 2012 完整版（工作站上）
- FIJI / ImageJ（免费，PC/Mac 均可）
Autosave（自动保存）
- 自动保存文件
- 将 .czi 分成独立文件（各通道、Z 面、时间点、位置）
- 必须存为 .czi（存为 .tif 颜色会错）
- 文件名 = 基名 + 日期时间 + 标识（ch/z/t 等）
TIF 批量导出
- 有宏可批量导出 .tif
- 操作：Macro → Batch Export
- 选择目录 → 高亮文件 → 单图/系列
- 单通道 tif 勾选 Monochrome，合并图不勾选并选通道
- 只能用 RGB 三色，DIC 明场无灰度选项
七、Z-Stack（Z 轴层扫）
操作步骤
- 勾选 Z-Stack 并打开窗口
- 向下聚焦到起始点 → 点 Set First
- 向上聚焦到终止点 → 点 Set Last
- 停止扫描
- 选择最佳步长
- 点击 Start Experiment
注意：总是向下聚焦设 First。Zen 只沿重力反方向采集
步长优化
- Optimal：50% 切片重叠（3D 成像最佳）
- Match Pinhole：无重叠无间隙
- X:Y:Z = 1：立方体像素
Z 系列查看
- Gallery：查看所有切片
- Ortho：任意位置横截面（盖玻片/起始点在外侧）
- 3D：实时旋转（用 Maximum Projection，House 图标复位）
- Cut：其他方向切片
3D 可视化和分析也可用 Volocity 软件
八、图像质量优化
饱和度检测（Range Indicator）
- 勾选 Range Indicator
- 饱和像素显示红色，零值像素显示蓝色
- 用 Split 视图分别调各通道
- 目标：最多少量红/蓝像素
- 定量分析：避免所有红/蓝像素，采集 12 bit 图像
- 重要：后期处理可以调亮/压暗，但无法消除已饱和的像素
图像质量优化对照表
| 目标 | 方法 | 范围 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|---|
| 增加亮度 | Master Gain ↑ | 450-750+ | 不增加光漂白 | 高增益放大噪声 |
| Laser Power ↑ | 2%-20% | 直接激发信号 | 增加光漂白 | |
| Pinhole 开大 | 1AU→ | 不增加噪声、不漂白 | Z 分辨率下降 | |
| Digital Gain ↑ | - | 仅影响显示 | 不改变原始数据 | |
| 提高信噪比 | Master Gain ↓ | <700 | 降低图像亮度 | — |
| Line Average ↑ | 2-8 | 重复扫描采集更多光 | 慢、增加光漂白 | |
| Scan Speed ↓ | 7-9 | 速度慢采集更多光 | 慢、增加光漂白 | |
| 提高速度 | Scan Speed ↑ | >9 | 快、损伤小 | 采集光少 |
| Bidirectional Scanning | 开/关 | 时间减半、不损失光 | 高分辨率可能有伪影 | |
| 提高分辨率 | Zoom ↑ | 到最小像素尺寸 | 像素减小 | 视场减小、光漂白增加 |
| pixels ↑ | 1024×1024 | 视场不变像素减小 | 每个像素光更少 | |
| Zoom + Tiling | - | 大区域高分辨率 | 耗时、光漂白、拼接可能有缝 | |
| 高 NA 物镜 | 1.2-1.4 | 可分辨更小物体 | — |
九、高级成像模式
多通道序列扫描（Multi-tracking）
- Smart Setup 中选 Smartest (Line)
- 检查项：通道、激光线、颜色、针孔、主分光器
- 针孔设置：最长波长通道设为 1 AU
- 线序（Line）方式：通道和激光开关可在轨迹间变化（推荐）
- 帧序（Frame）方式：针孔/分光器等可在轨迹间变化（反射光常用）
时间序列（Time Series）
- 点击顶部 Time Series
- 设置间隔和总扫描次数
- 点击 Start Experiment
- 如同时勾选 Z-Stack，将获得 xyzt 四维数据
- 配合 Definite Focus 可长时间保持聚焦
拼接扫描（Tile Scan）
- 用途：高分辨率下获取大视场
- 设置瓷砖数（如 3×3、2×2、2×8，可非方形）
- 旋转图像以适配瓷砖网格
- 先扫概览图快速预览
- 每个瓷砖可做 Z-stack
- 注意：Tile Scan 创建单张大图，拼接并非完美。完美拼接用 Multitime Macro（较慢，不支持旋转）
多点位成像（Positions / Multi X-Y-Z）
- 点击左上角 Positions
- 移到目标 X-Y-Z 位置 → Add position
- 重复添加多个位置
- 返回第一个位置 → Start Experiment
- 多位置 Z-stack：
- 第一个位置用 Center 选项定义 Z 栈
- 其余位置只需在物体中心添加
- 各位置范围和步长必须相同
光漂白/光激活（FRAP / Photoactivation）
- 顶部选 Bleach（自动激活 Time Series 和 Regions）
- 设置漂白前扫描次数
- Iterations = 漂白期间扫描次数（越多漂白越强）
- 设置激光和功率（405nm 高功率漂白最快）
- 慢扫描速度 = 更好漂白效果，可用更少迭代
- Zoom bleach 更快但空间精度较低
- 定义区域（也要定义对照区域）
- 设置时间序列（不含漂白步骤，仅暂停）
- Start Experiment
注意：实际漂白区域可能比定义的大，尤其在焦平面上下
反射光共聚焦（Reflected Light Confocal）
- 主分光器设为 T80/R20
- 勾选 Reflection
- 在所需激光线下创建小区域
- 可同时做荧光和反射光
- 荧光更亮用帧序扫描
- 405 nm 线不可用
明场透射光（Transmitted Light / Bright Field）
- Light Path 窗口中点击 T-PMT
- 调整 Gain（亮度）和 Offset（黑电平/对比度）
- Offset 可为负值以增加对比度
- 使用当前激活的所有激光
- 注意：此图像不是光学切片
- 高质量明场看 DIC 部分
定焦系统（Definite Focus）
- 用 750nm 远红激光找到盖玻片，维持物镜到盖玻片距离恒定
- 不追踪移动的细胞
- 支持时间序列 ± Z 系列、多点位、拼接
- 两次采集间隔最好 >10 秒
- 设置：Touch Pad → Home → Microscope → XYZ → Definite Focus → ON/Once
- Zen 中：Focus Devices and Strategy → 勾选 Time → 选 Definite focus → 设置检查频率
十、DIC（微分干涉相差）
目镜观察 DIC
- 先设置 Kohler 照明：
- 关闭视场光阑
- 调节聚光镜高度，看到清晰的多边形光斑
- 用对中螺丝居中
- 打开视场光阑充满视场
- 聚光镜设置：
- 左侧孔径光阑：DIC 全开，明场半开增加对比度
- 右侧设置：DICII（25x）/ DICIII（40x/63x）
- 滤光片立方体：右调焦旋钮选 POL
- 上偏光镜：目镜观察时向左旋，共聚焦采集时向右旋
- Wollaston 棱镜：每个物镜一个（10x 除外），使用前插入
共聚焦 DIC 采集
- 上偏光镜旋到右侧
- 确认聚光镜设置在 DICII 或 DICIII
- 点击 T-PMT
- Offset 设为较大负值，Gain 按需调高（增加对比度）
- 扫描时可调整 Wollaston 棱镜
十一、Zen Light 2012 Browser（免费浏览器）
版本区别
- Black 版：共聚焦功能更多（推荐）
- Blue 版：图像处理/分析功能更强
- 两者都支持 3D 旋转
- 32 位电脑只能用 Blue 版
- Mac 无 Zen 版本，但可用 FIJI 打开 .czi
主要功能
- Export to .tif：File → Export → Export Raw Data
- 单平面/系列、RGB/单色调色板
- 8/12/16 bit tif
- Full resolution / Image window（截屏方式）
- 复制子集（Copy Subset）：Processing → Copy → Subset
- 从 Z 栈/时间序列中删除帧，或 X-Y 裁剪
- 3D 功能：旋转、表面阴影、制作 AVI 影片等
- 高级 3D 推荐用 Volocity
十二、图像亮度与对比度调整
Photoshop（推荐）
- Image → Adjustments → Levels（Ctrl+L）
- 选择颜色通道
- 直方图三角滑块调整
- 中间三角 = Gamma，影响亮度线性
- Gamma 可在不饱和亮区的前提下提亮暗区
- 保存时用新文件名（会永久改变像素值）
ImageJ / Fiji
- Image → Adjust → Brightness/Contrast 或 Color Balance
- 同时有直方图调整和亮度对比度调整
- 无 Gamma 调节
- 重要：始终保留原始 .czi 文件，调整后另存新文件
十三、技术规格汇总
调焦
- 粗调：1 圈 = 2 mm
- 微调：1 圈 = 0.2 mm（200 μm）
载物台速度 & 调焦速度
| 物镜 | 载物台速度 | 调焦速度 |
|---|---|---|
| 10x | 7 | 4 |
| 25x | 5 | 3 |
| 40x | 5 | 2 |
| 63x | 3 | 1 |
荧光滤光片组（Axio Observer .Z1）
| 位置 | 激发滤光片 | 分光器 | 发射滤光片 | 用途 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | G365 | FT 395 | LP 420 | DAPI/UV |
| 2 | BP 470/40 | FT 510 | LP 515 | GFP/FITC |
| 3 | BP 546/12 | FT 580 | LP 590 | Rhodamine |
| POL | — | — | — | DIC 偏光 |
注意：目镜荧光用汞卤灯，不用激光。蓝/绿滤光片是长通（LP），可看到所有颜色，不用于共聚焦成像。
十四、常见错误与故障排除
Inkubator 错误
- 启动时右下角出现 “Error…Inkubator…”
- 处理：忽略即可，除非你要用孵育箱
目镜模式无光
- 检查是否点了 Online
- 屏幕图形中灯是否亮
- 荧光模式下功率是否 >0%
- 快门是否打开
- 都正常的话：点 Offline 再 Online（通常能解决）
Zen 软件无法加载
蓝条在 1/4 处停止：
- 停止并退出
- 找到 RTC（Real Time Controller，角落大黑箱）
- 打开前门，按复位按钮（黄色三角）
- 等红灯闪烁（约1分钟）
- 重启 Zen
蓝条在接近末尾处停止：
- 左下角会有更多错误信息
- 需要重启一切：
- 停止 Zen，重启 Windows
- 关闭白色控制盒所有按钮
- 快速打开 Main
- 等 5 秒，开 2 个小按钮
- 开关激光钥匙
- 可能需要完全关机再开
关联笔记
- 徕卡TCS SP8 STED共聚焦显微镜快速操作手册（Leica 竞品对照）
- 奥林巴斯FV3000共聚焦激光扫描显微镜产品手册（Olympus 竞品对照）
- 共聚焦软件使用说明-功能模块手册（自研共聚焦软件功能）
- 共聚焦显微镜操作软件需求说明（自研软件需求）
- 共聚焦扫描模式参数对照表（6种扫描模式对比）