Nikon A1R 共聚焦显微镜用户操作手册
Nikon A1R + SIM 共聚焦显微镜用户操作协议（User Protocol），共 12 页。 软件版本：NIS Elements AR 4.51.00 配套设备：Nikon A1R + SIM（结构光照明显微镜）
重要提醒
- 系统保持常开：Nikon A1R + SIM 始终处于开机状态，不要关闭整个系统
- 只需关闭激光钥匙和落射荧光灯
- 图像文件保存到 D 盘，不要保存到 C 盘或网络盘
- 用完后需将文件从 D 盘转移到网络盘，并删除 D 盘原文件
一、开机流程（Laser Start Up）
- 打开激光钥匙：转动设备中间箱体上的钥匙
- 打开电脑（如果尚未开机）
- 启动软件：
- 打开 NIS Elements AR 4.51.00
- 选择 Confocal（共聚焦模式）
左侧菜单栏常用按钮：
- Laser Unit（激光单元）
- Arrow（箭头工具）
- Magnifier（放大镜）
- ND Acquisition（多维采集）
- Close all images（关闭所有图像）
二、目镜观察（Visualization Through Eyepieces）
- 选择物镜：从 TiPad 菜单中选择物镜
- 选择荧光基团：在 OC 面板的 EYES 下选择要观察的荧光基团
- 打开落射荧光灯：点击气浮台上的 Epifluorescent on/off 按钮
- 通过目镜对焦样品
- 切换到共聚焦模式：
- 选择 Confocal Ready + TD
- 荧光灯会自动关闭
- 点击 Remove Interlock（解除联锁）
- 联锁解除约需 10 秒
三、激光与 PMT 设置（Laser and PMT Set-up）
3.1 扫描器选择
| 扫描器 | 特点 |
|---|---|
| Galvano（振镜） | 速度慢，分辨率高 |
| Resonant（共振镜） | 分辨率稍低，速度非常快 |
默认情况下软件会同时打开所有激光。如需序列采集（Sequential Acquisition），选择 Ch Series。
3.2 设置步骤
- 选择扫描器（Galvano / Resonant）
- 为目标荧光基团设置针孔（Pinhole）——NIS Elements 所有波长共用一个针孔
- 确保未选中 Fast Mode（快速模式）
- 关闭所有激光，只保留当前使用的激光线
- 点击 Scan 开始/停止激光扫描
- 在图像窗口中打开饱和度指示器（Saturation Indicator）
- 切换为单色显示：右键通道标签 → Channel Coloring → Mono
- 逐个激光通道调整参数：
- 激光功率（Laser Power）：越低越好（减少光漂白）
- 增益（Gain / HV (G)）：不要超过 120
- Offset：保持为 0
- 注意观察饱和度指示器
⚠️ 注意：在调整下一个激光前，先打开对应的激光。
四、像素大小调整（Pixel Size Adjustment）
- 默认图像大小：512 × 512
- Nyquist XY：增加采样率（XY 步长更小）
- 获得最佳空间分辨率
- 扫描面积减小，像素尺寸变小
- 可以在保持 Nyquist 采样率的同时增大扫描面积
- 按相应按钮可恢复全扫描面积
五、图像采集（Capture Final Image）
在 A1plus Compact GUI 中设置：
- 像素驻留时间（Pixel dwell）/ 帧率（Frame/sec）：控制采集速度
- 图像大小（Image size）：如不使用 Nyquist XY 可自行设置
- 平均次数（Averaging）：提高图像质量
- 单向 vs 双向扫描（Unidirectional vs Bidirectional）
- 点击采集图像
六、共振扫描模式（Resonant Scanning Mode）
与振镜扫描类似，但有以下限制：
- 不可调节速度
- 不可更改图像大小
- 可通过 Scan Zoom 功能在 A1Plus Scan Area 窗口中缩小帧尺寸
七、多维采集（Multidimensional Acquisition）
7.1 时间序列（Time）
- 可设置多种采集间隔和持续时间
7.2 XY 多点采集（XY Position）
- 可选择多个 XY 位置
- 可选择是否启用 PFS（完美聚焦系统）控制
7.3 Z 轴层扫（Z Stacks）
三种定义方式：
- 定义上下边界（Defined Top and Bottom）——最常用
- 对称 Z 层扫（Symmetric Z stack）
- 非对称 Z 层扫（Asymmetric Z stack）
上下边界法操作步骤：
- 选择能照亮整个 Z 轴范围的激光，关闭其他激光
- 开始扫描，用调焦旋钮向上调直到样品失焦 → 点击 Top
- 反向调焦直到样品再次失焦 → 点击 Bottom
- 设置步长：为获得最大采样频率，选择 Step 选项旁的 Nyquist 值
八、ND 采集与保存（ND Acquisition and Saving）
- 点击 Save to File
- 浏览到 D 盘保存（不要存到 C 盘或网络盘）
- 命名文件
- 实验设置可组合多种维度：
- T = 时间点（Time points）
- M = 多 XY 位置（Multiple XY positions）
- Z = Z 层扫（Z stacks）
- Run 1 time loop：运行一次时间循环
- Run now：开始多维采集实验
九、系统关机（System Shutdown）
- 保存所有图像，关闭 NIS 软件
- 将文件从 D 盘传输到影像网络盘
- 保存到其他位置后，务必删除 D 盘上的原文件
- 关闭落射荧光灯按钮
- 关闭共聚焦激光钥匙
- 系统其余部分保持开机！
十、界面面板速览
10.1 OC 面板 + TiPad（目镜观察）
- OC for Eyes（目镜光路）
- Objective selection（物镜选择）
- Z escape（Z 轴快速移位）
- Light port（光路端口）
- Z drive（Z 轴驱动）
- Diascopic shutter for BF（明场透射光闸）
- Filter Turret for Epifluor（落射荧光滤光片塔）
- Filter Turret for SIM（SIM 滤光片塔）
- Emission wheel for SIM（SIM 发射滤光片轮）
- Perfect Focus（完美聚焦系统）
10.2 A1Plus Compact GUI（共聚焦主界面）
- Image scan and capture（图像扫描与采集）
- Scanner selection（扫描器选择）
- Scanning direction（扫描方向）
- Pinhole Diameter（针孔直径）
- Scan speed（扫描速度）
- Image Size (ppi)（图像大小）
- Averaging and Summation（平均与累加）
- Sequential scanning（序列扫描）
- Laser Path（激光光路）
- Laser controls（激光控制）
10.3 Scan Area（扫描区域面板）
- Image area（图像区域）
- FOV 全视场
- Full scan（全扫描）
- Scan area（扫描区域）
- Updated pixel size（更新后的像素大小）
- Reset（重置）
- Optimal sampling step size（最佳采样步长）
十一、完美聚焦系统（Perfect Focus System, PFS）
工作原理： 红外 LED 发出的光进入光路，从盖玻片反射的信号返回并由线阵 CCD（Line-CCD）检测。 PFS 偏移控制器调节偏移透镜（Offset Lens），从而使物镜在 Z 轴上调整位置，保持聚焦稳定。
关键参数速查
| 参数 | 推荐值/限制 |
|---|---|
| PMT Gain (HV) | ≤ 120 |
| Offset | 0 |
| 默认图像大小 | 512 × 512 |
| 针孔 | 单针孔，所有波长共用 |
| 激光功率 | 越低越好 |
| 保存位置 | D 盘（禁止 C 盘/网络盘） |
| 系统状态 | 常开，仅关激光钥匙和荧光灯 |
| 扫描器 | Galvano（高分辨率）/ Resonant（高速） |