奥林巴斯 FV1000 激光共聚焦显微镜简易使用说明书
光谱扫描型，配套 IX81 倒置显微镜，FV10-ASW 1.1 操作软件。 面向实验操作人员的快速入门操作指南，涵盖开机→镜下观察→多种取图模式→图像分析→保存→关机全流程。
一、系统启动流程
- 打开计算机
- 打开激光器（钥匙开关）
- 多线氩离子激光器（458 nm / 488 nm / 514 nm）：开电源开关 → 开钥匙开关
- 氦氖绿激光器（543 nm）
- 氦氖红激光器（633 nm）
- 打开汞灯电源开关
- 登录 Windows XP
- User ID：
Administrator - Password：
fluoview
- User ID：
- 启动 FV10-ASW 软件
- 双击桌面「FV10-ASW 1.1」快捷方式
- 软件登录：User ID
Administrator/ PasswordAdministrator - 注意：软件启动需要等待一定时间
二、显微镜镜下观察
2.1 微分干涉差（DIC）观察
| 步骤 | 操作 |
|---|---|
| 1 | 使用手控面板选择物镜 |
| 2 | 插入起偏镜 |
| 3 | 插入微分干涉滑块 |
| 4 | 点击 FV10-ASW 软件中的 DIC 图标 |
| 5 | 标本聚焦 |
注意事项：
- 使用 TD 滑块控制卤素灯光强
- 检查滤色片转盘位置是否为「6.DICT」，如不是用手柄按下 DICT 图标
- 转换物镜倍率后，需对物镜和对应 DIC 元件同步操作
- 用微分干涉旋钮调节对比度
2.2 荧光观察
| 步骤 | 操作 |
|---|---|
| 1 | 使用手控面板选择物镜 |
| 2 | 点击 FV10-ASW 软件中的目镜观察按钮（进入荧光观察状态） |
| 3 | 使用手控面板选择荧光滤色片 |
| 4 | 标本聚焦 |
注意事项：
- 进入荧光观察前确认汞灯机械快门要打开（建议平时放在关闭位置●）
- 检查 DIC 滑块是否拉出（荧光观察时 DIC 滑块须拉出）
- 观察前确认汞灯机械快门在开启位置○
荧光滤色片参考：
| 滤色片 | 激发/发射 | 典型染料 |
|---|---|---|
| NIBA | 蓝色激发 / 绿色荧光 | FITC、EGFP 等 |
| WIG | 绿色激发 / 红色荧光 | Rhodamine、DsRed 等 |
三、取图操作界面概览
FV10-ASW 软件三大界面区域：
3.1 采集设置区（顶部）
- 扫描模式、扫描速度、像素数、缩放和平移、激光输出调节
- Lambda 扫描设定、物镜、聚焦、时间间隔和时间计数（XYT/XT 用）
3.2 通道/扫描设置区（中部）
- 明场观察 / 荧光观察 / 染料选择 / 光路图
- λ 扫描带宽选择、TwinScanner 设定
- 取图条件保存与调出
- 扫描按钮、XYZ/XYT/XYL 选择、每个通道调节
- 共聚焦孔径大小、卤素灯光强、Kalman 方式
3.3 图像浏览区（底部）
- 图像显示窗口、图像缩略索引、内存中文件列表
四、取图操作（核心章节）
4.1 XY 平面单标（以 FITC 绿色荧光为例）
| 步骤 | 操作 |
|---|---|
| 1 | 关闭汞灯快门 + 关闭卤素灯快门 |
| 2 | 点击染料选择按钮 → 染料列表中双击目标荧光染料 |
| 3 | 点击 Apply 按钮确认 |
| 4 | 点击 XY Repeat 按钮开始连续扫描 |
| 5 | 调节图像（HV 灵敏度 / C.A. 孔径 / Laser 激光强度） |
| 6 | 点击 Stop 按钮停止扫描 |
图像调节三要素：
- HV：探测器灵敏度调节（点击滑块跳变，上下按钮或鼠标滚轮微调）
- C.A.：共聚焦孔径大小调节
- Laser：激光输出强度调节
扫描控制按钮：
- XY Repeat：连续扫描
- Stop：停止扫描
- Fast x2 / Fast x4：快速扫描（隔行扫描）
4.2 XY 平面双标（同步扫描方式）
适用：绿色荧光（Alexa 488）+ 红色荧光（Alexa 546）二重染色
| 步骤 | 操作 |
|---|---|
| 1-3 | 同单标：关闭汞灯/卤素灯快门 → 染料选择（选两种）→ Apply |
| 4-5 | 点击 XY Repeat 开始扫描 → 调节各通道图像 |
| 6 | 点击 Stop 停止扫描 |
同步 vs 序列扫描：
- 同步扫描（Simultaneous）：多通道同时扫描，速度快，可能有串色
- 序列扫描（Sequential）：通道分时扫描，串色少，速度慢（详见 4.3）
4.3 XY 平面双标（序列扫描方式）
| 步骤 | 操作 |
|---|---|
| 7 | 选择 AutoHV，选择扫描速度（速度越慢，背景噪音越低，同等亮度下更干净） |
| 8 | 点击 XY 按钮取得一幅图像 |
| 9 | 点击 SeriesDone 按钮，弹出 2D View-LiveImage(x) 界面 |
| 10 | 保存图像：右击图像管理器图标 → 另存为 |
序列扫描方式： Line / Frame / Group 多种分时模式可选，有效减少通道间串色。
4.4 XY 平面单标 + 微分干涉差
荧光通道与 DIC 通道叠加成像，同时获得荧光定位与细胞结构信息。 操作流程：荧光通道设置 → DIC 通道开启 → 采集 → 保存。
4.5 XYZ 扫描双标（Z-Stack 三维扫描）
| 步骤 | 操作 |
|---|---|
| 1-8 | 设置双标染料 → 设定上下限扫描范围 → 选择扫描参数 |
| 9 | 选择 AutoHV + 扫描速度 |
| 10 | 选择 Depth 按钮设置 Z 轴参数 |
| 11 | 点击 XYZ 按钮取得三维图像 |
| 12 | 点击 SeriesDone → 2D View 界面出现 |
| 13 | 保存图像（OIF/OIB 格式保存完整三维数据） |
4.6 XYL 光谱扫描
Lambda 扫描模式：在不同发射波长下连续采集，获得每个像素的全光谱信息，用于后续光谱拆分（Unmixing）。
五、2D 操作界面与图像分析
5.1 打开文件
从图像管理器或文件菜单打开已保存的图像文件。
5.2 3D 图像的叠加（Projection）
- 点击投影按钮并选择投影方式
- 保存：右击图像 → Save Display → 命名保存
右键菜单功能： Full Screen Image / Send to Clipboard / Save Display / Save as AVI / Print / Select All ROIs / Map Selection / Delete All ROIs / Show Profile (X/Y axis) / Show Overlay
5.3 比例尺的使用
在图像上添加和校准比例尺，用于尺寸测量。
5.4 3D 图像的重建
对 Z-Stack 数据进行 3D 体积重建（Volume Rendering）。
5.5 3D 图像的旋转与动画导出
旋转动画保存为 AVI：
- 点击
<< More - 点击 Angle rotation 菜单
- 选择旋转轴（X / Y / Z）
- 输入旋转角度参数
| 参数 | 含义 |
|---|---|
| Start | 开始角度 |
| End | 结束角度 |
| Frame/s | 旋转速度（帧率） |
| Interval | 单次旋转的角度步长 |
- 选择 AVI 类型并点击 Create
- 输入文件名 → Save
示例：旋转 180 度动画 — Start=-180, End=180, Frame/s=5, Interval=30
5.6 Unmixing（光谱拆分）
利用 Lambda 扫描获得的光谱信息，将重叠荧光信号拆分为独立通道，消除串色。
- 需要预先采集各染料的参考光谱
- 适用于多色标记且光谱重叠严重的样品
5.7 保存图像
四种保存场景：
| 场景 | 操作 | 格式 |
|---|---|---|
| 单通道图像保存 | 右击图像管理器图标 → 另存为 → TIFF | TIFF / BMP / JPEG |
| 多通道合并图像保存 | 右击 → 另存为 → TIFF → 勾选合并通道 | TIFF / BMP / JPEG |
| 带比例尺图像保存 | 右击图像 → Save Display → 命名 | BMP |
| 动态/旋转图像保存 | 右击图像 → Save as AVI → 命名 | AVI |
FV10-ASW 专用格式：
- OIF 格式：一个 16-bit TIFF 图像 + 一个附属文件，不可分割
- OIB 格式：单个文件（OIF 的打包版本），方便移动和管理
六、保存到 CD-R
将采集的图像数据刻录到 CD-R 光盘归档（第 36 页）。
七、关闭系统
- 退出 FV10-ASW 软件
- 关闭激光器钥匙开关 → 关闭激光器电源
- 关闭汞灯电源
- 关闭计算机
- 关闭显微镜主机电源
⚠️ 汞灯关闭后不要立即重启，需等待冷却，否则会显著缩短汞灯寿命。
八、附录
附录 1：图像调节详细说明
HV / Gain / Offset / Laser / C.A. 各参数详细调节方法。
附录 2：降低背景噪音的两种方法
| 方法 | 原理 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 降低扫描速度 | 探测器逐像素延长采样时间，忽略背景噪音 | 图像更锐利 | 单次扫描速度慢 |
| Kalman 方式 | 多次扫描取平均（Line/Frame 两种），去除噪音和粗糙度 | 单次扫描速度快 | 平均导致图像略模糊 |
Kalman 操作：
- 点击 Kalman 按钮 → 选择 Line 或 Frame 方式
- 输入累计数字（扫描次数）
AutoHV 模式：
- Auto ON：扫描速度变慢时，背景噪音降低，图像亮度保持不变
- Auto OFF：扫描速度变慢时，背景噪音降低，图像亮度随之增加
九、与其他奥林巴斯共聚焦资料的关联
- 本手册为 FV1000 简易版入门操作指南，侧重操作步骤
- 硬件技术细节参考 Olympus FV1000共聚焦显微镜硬件手册
- 完整硬件用户手册参考 Olympus FV1000共聚焦显微镜硬件用户手册
- 新一代 FV3000 系列参考 奥林巴斯FV3000共聚焦激光扫描显微镜产品手册 和 奥林巴斯FV3000倒置共聚焦软件使用说明
- 共聚焦原理与生物医学应用参考 激光共聚焦显微镜技术-生物医学应用课件
- 与蔡司/徕卡共聚焦操作对比，可参考 Zeiss 710 共聚焦显微镜用户指南-康奈尔BRC、徕卡TCS SP8 STED共聚焦显微镜快速操作手册 等四大家资料
关键字
FV1000 IX81 FV10-ASW 光谱扫描型 共聚焦操作 Z-Stack Lambda扫描 Unmixing Kalman AutoHV OIF OIB 3D重建