Zeiss LSM 800 共聚焦显微镜用户指南 - IREC 成像平台
IREC (Institute of Experimental and Clinical Research) 成像平台编写的 Zeiss LSM 800 (配 Airyscan 超分辨模块) 共聚焦显微镜用户操作手册。软件为 ZEN BLUE 版本，面向平台用户的标准操作流程 (SOP)。
一、平台概览
平台组织
- 管理模式：由物流管理员 (logistician) 日常管理，协助技术人员和行政人员
- 服务内容：实验方案咨询、培训、设备操作、技术监测、基金申请支持、设备采购评估
- 预约系统：http://www.fath.ucl.ac.be/reservation/login.php
- 开放对象：所有学术和私营部门科学家，先到先得，无优先级
- 费用：按网站公示价目收费，或提供初步报价
用户义务
- 首次使用前必须接受培训并获取预约系统访问权限
- 使用本人姓名预约，遵守时间
- 取消/修改预约需立即通知排队人员
- 最后一位使用者关机并锁门
- 保持设备和房间整洁
- 故障/错误立即报告管理员并记录在专用笔记本
- 危险样品（未固定人样、病原体、放射性）禁止在成像设备上使用
- 培训和服务请求需提前 2 天预约
- 平台需在发表论文中被致谢
二、系统配置
物镜配置
| 物镜 | 浸没方式 | 适用样品 |
|---|---|---|
| 10x | 无浸没 | 标准培养皿（厚底），唯一可用于厚底的物镜 |
| 20x | 无浸没 | — |
| 40x | 油浸 (OIL) | 固体封片剂样品 |
| 63x | 油浸 (OIL) | 固体封片剂样品 |
| 63x | 水浸 (WATER) | 培养基、PBS 等液体样品（活细胞成像） |
注意：液体封片剂 禁止使用。 警告：油/水浸没液绝不能混淆，也不要加太多。
激光器与通道
- 预定义荧光配置：DAPI、AF488、AF555
- AF647 不可用肉眼观察（人眼不可见）
- 明场 (BF) 和 DIC 模式可用（DIC 仅 40x OIL 和 63x W）
三、开机流程
- 选择样品架：根据样品类型（培养皿/培养小室/玻片）选择合适的插入架
- 适用：薄玻璃底培养皿、Labtek/Ibidi 培养小室、盖玻片
- 打开电源插座（显微镜后方）
- 按顺序开机（PSU 和 LM 单元上）：
- 系统 PC (1) → 组件 (2) → 检查激光器 (3) 是否已开启
- 移除载物台上的保护盖
- 打开计算机
- 启动 ZEN blue 软件，选择 ZEN system 采集图像
- 系统初始化后，接受自动「载物台/对焦」校准（Calibrate now）
四、ZEN BLUE 界面
四区布局
- 左侧：采集设置控制面板 (Control panel)
- 中间：图像预览窗口 (Preview window)
- 底部：已采集图像显示控制（亮度、对比度、标尺等）(Display controls)
- 右侧：已采集图像列表 + 样品导航工具 (Gallery)
四大标签页
| 标签 | 功能 |
|---|---|
| Locate | 显微镜观察模式，光路控制，目镜观察选区域 |
| Acquisition | 图像采集（共聚焦、Airyscan、Z-stack、Tile） |
| Processing | 图像处理（如 Airyscan 后处理、拼接） |
| Analysis | 集成分析模块 |
五、样品观察 (Locate 模式)
分步操作
1. 样品定位
- 选低倍物镜（10x-20x，无浸没）——触摸屏或 microscope control 标签
- 降低载物台至「Load position」（防碰物镜）
- 向后倾斜显微镜支架
- 放置样品（盖玻片朝向物镜）
- 升起载物台，支架复位
2. 开启光源
- 荧光：Reflected light On + 预定义配置（DAPI / AF488 / AF555）
- 白光明场：Transmitted light On + BF 配置（光漂白时用）
- 白光 DIC：Transmitted light On + DIC 配置（仅 40x OIL / 63x W）
3. 切换高倍物镜
- 触摸屏选择目标物镜 → 载物台自动下降
- 用操作杆后移样品以接近物镜
- 滴加浸没液（油/水，勿混淆，勿过量）
- 操作杆移回样品至物镜上方
- 触摸屏点击「Done」升起载物台
方法 2（保留视野位置切换物镜）：
- 切换前展开右侧面板 → Stage 窗口 → Z-Values → 记录当前 X/Y/Z 位置
- 切换物镜、加浸没液后，将样品移回存储位置 → 升起载物台
4. 用操作杆选视野并对焦 5. 切换至采集模式
六、共聚焦采集 (Acquisition 模式)
6.1 采集配置三种方式
重要：同一实验中必须使用相同采集参数才能比较结果！参数可保存复用。
a) 复用已有图像的参数：打开图像 → 点击「Reuse」
b) 加载已有模板：如 SOP 模板（4 通道：647/568/488/DAPI，共聚焦 LSM 或明场 WF）
c) SMART SETUP 新建配置
- 选采集模式：LSM（共聚焦或 Airyscan）或 WF（明场）
- 选择荧光染料
- 选采集模式：
| 模式 | 特点 | 适用场景 |
|---|---|---|
| Fastest | 多通道同时采集，最快 | 光谱分离良好的荧光素 |
| Best signal | 逐通道切换配置，最慢，信号最好 | 光谱接近或需不同针孔设置 |
| Smartest | 顺序+同时组合，折中 | 活细胞多色成像 |
三种模式均从高波长（低能量）开始采集。
6.2 采集参数优化
a) Imaging setup（成像设置）
- 显示轨迹与荧光素发射光谱
- 可添加/重命名轨迹 (Track)
- 每条轨迹可调可变二向色镜 (VSD) 和发射滤光片，修改关联颜色
- 光谱重叠时调整检测波长
- 轨迹切换方式：line / frame / frame fast
- 优先选「Frame」（Line 和 Frame fast 要求各轨迹检测器位置相同）
b) Channels（通道调节）
- 选中一个通道（荧光素）
- 点击调整激发/发射参数
- 开启 Range indicator（假色显示）：
- 蓝色像素 = 背景（无信号）
- 红色像素 = 饱和
- 逐通道调整：
- Master Gain（检测器电压，650-900V）：升高直到出现少量红色饱和像素
- Laser power（激光功率，最大 5%）：增益不够时再增加
- Pinhole（针孔孔径，1 Airy Unit = 标准共聚焦光学切片厚度）
- 共定位研究所有通道必须用相同值！
- Digital offset（数字偏移）：降低以减少背景噪声，直到背景全为蓝色
- 调焦（预览窗口 Ctrl + 滚轮）
- 双击感兴趣区域居中
- 停止实时成像
- 重复其他通道/轨迹
c) Acquisition mode（采集模式）
- 扫描区域：裁剪工具 (digital zoom) + 扫描区域（旋转、XY 移动）
- 图像尺寸/分辨率：选「optimal」自动满足 Nyquist 采样定理
- 像素越少 → 分辨率越低
- 扫描速度：1-2 µs/pixel 为最优信号质量
- 速度越快 → 分辨率越低
- 扫描方向：优先单向扫描；双向需对齐（对齐不良会出现重影）
- Averaging（平均）：
- 降背景：Mean intensity（推荐）
- 增强信号：Sum intensity（不推荐）
- 按行或帧重复，可选 2/4/8/16 次平均
6.3 开始采集
点击开始按钮。
七、Airyscan 超分辨采集
需使用 63x 物镜（油浸或水浸）
- 配置采集参数：同共聚焦（Smart Setup 中选 Airyscan）
- 优化参数：
- 裁剪至感兴趣区域
- 其他参数同共聚焦
- 无需调节针孔（Airyscan 模式下针孔全开）
- 开始采集 (SNAP)
- 后处理（反卷积 + 像素重分配）：
- 控制面板选 Processing
- Method 选 Airyscan Processing
- 点击 Apply
八、Z-Stack 三维采集
- 选 Z-stack 模式，弹出 Z-Stack 窗口
- Live 模式下选视野和通道，确定成像厚度
- 选 First/Last 模式
- 移至样品顶部 → 点击「Set Last」
- 移至样品底部 → 点击「Set First」
- 选最佳光学切片厚度（「optimal」按钮高亮时自动满足 Nyquist）
- 点击「Start experiment」开始采集
MIP（最大强度投影）创建
- 保存图像（.czi 格式）
- 预览窗口选 Ortho
- 显示窗口勾选 Maximum Intensity Projection
- 创建新图像
- 保存
九、Tile Scan 大图拼接
简单设置法 (Method 1)
- 选 Tiles 模式，弹出 Tiles 窗口
- Options 中定义拼接重叠率（默认 10%）
- Tile Regions → 选轮廓方式：
- Tiles：定义 tile 数量（如 X=5 Y=5 → 25 tiles，当前位置为中心）
- Size：定义区域尺寸
- Stake：Live 导航中点击 + 添加标记点，软件自动计算 tile 数
- （可选）结合 Z-stack 时，移至中心 Z 位置
- 点击 + 添加到 tile 列表
高级设置法 (Method 2)
- 自动进入 Live
- Tile Region Setup 中画大方框，导航调整使其包含整个样品
- 低倍预览扫描
- 在预览图上用轮廓工具画出高倍成像区域 → 自动添加到 tile 列表
非平面样品（聚焦曲面）
- Focus surface → 选插值阶数（>4 个焦点）
- 预览图上画样品轮廓框
- 选 Live in Separate Container
- 导航至不同视野，调焦后点击 + 添加焦点
采集与拼接
- 选要采集的 tile 设置
- （可选）重命名 tile
- Start Experiment
- 拼接 (Stitching)：
- Processing 标签
- Method 选 Stitching
- New Output + Fuse Tiles + Correct shading
- Apply
十、图像显示
- 2D 叠加显示：底部红框选通道（取消勾选隐藏对应通道）
- Split 模式：各通道分开展示
- Gallery 模式：Z-stack 或 Tile 逐张查看
- Info：保存采集信息（激光功率、平均次数、物镜等）
- Display 标签：逐通道调整动态曲线（手动或 min/max）
- 可复制/粘贴参数到所有图像，便于染色强度比较
- 标尺：Graphics 中选 Scale bar 图标
- 右键「Scale bar」修改格式（粗细、字体）
十一、保存与导出
保存
- CZI 格式（原生格式，保留所有信息，后续分析必需！）
- File → Save as CZI / Save all
- 可用 ZEN Lite 软件（免费下载）进一步处理
导出与数据转移
- 用平台内电脑清洁 U 盘
- 转移图像到 U 盘
十二、关机流程
- 清洁使用过的物镜：先用干镜头纸，再用异丙醇
- 切换回 10x 物镜
- 关闭 ZEN BLUE 软件
- 2 小时内无下一位用户时：
- 关闭计算机
- PSU 和 LM 单元上按顺序关机：Components → System PC
- 关闭电源插座（显微镜后方）
- 盖回显微镜保护罩
与其他共聚焦资料的关联
- 同品牌：Zeiss 710 共聚焦显微镜用户指南-康奈尔BRC（LSM 710，ZEN black 版本，康奈尔 BRC 编写）
- 同平台不同品牌：徕卡TCS-SP8-STED共聚焦显微镜快速操作手册（Leica TCS SP8 STED）、奥林巴斯FV3000共聚焦激光扫描显微镜产品手册（Olympus FV3000）
- 项目文档：共聚焦软件使用说明-功能模块手册、共聚焦显微镜操作软件需求说明
- 采集模式参考：共聚焦扫描模式参数对照表