Leica TCS SP5 共聚焦显微镜中文操作手册
整理者：jennifer 编制的内部操作培训手册 设备：Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜 软件：LAS AF（Leica Application Suite Advanced Fluorescence） 适用版本：LAS AF 1.3.1 build 525 页数：17 页
一、开机流程（第1-3页）
1.1 控制箱开机
控制箱面板从左到右三个绿色按钮：
- PC Microscope — 显微镜电脑主机电源
- Scanner Power — 扫描头电源
- Laser Power — 激光器电源
- Laser Emission 钥匙开关 — 激光发射锁，拧到 On-1 档位（钥匙拧90度）
操作顺序：先开前两个电源，再开 Laser Power，最后拧钥匙到 On-1
1.2 外围设备开机
- 激光器主机 — 独立激光单元，电源开关 + 状态指示灯
- 汞灯光源电源（ebq 100） — 荧光明场光源
- POWER 电源开关
- 数字显示屏（显示汞灯使用时长）
- LAMP / SAFETY / TEMP 状态指示灯
- EL6000 设备 — 荧光光源
- 电源开关
- 光强显示屏幕
- 快门键（Shutter）
- 光强调节旋钮
1.3 软件启动
- 双击桌面 LAS AF 软件图标
- 启动界面中勾选 Activate Resonant Scanner（激活共振扫描器）
- 点击 OK 按钮启动软件
- 等待初始化完成，进入 LAS AF 主操作界面
LAS AF 启动过程：Init Hardware Server → Started Server → Check configuration
1.4 LAS AF 主界面布局
- 顶部标签页：Configuration（配置）、Acquire（采集）、Process（处理）
- 左侧面板：采集模式 / 显微镜光路示意图 / Z轴位置
- 右侧面板：Beam Path Setup（光路设置）/ 光谱条 / PMT通道控制
- 底部按钮：Live（实时预览）、Capture Image（采集图像）、Start（开始扫描）
二、物镜选择与调焦（第4-5页）
2.1 物镜选择
硬件方式：转动显微镜机身的物镜切换旋钮
软件方式：在 LAS AF 软件的 Objective 区域点击，弹出物镜下拉菜单可选物镜列表：
| 物镜型号 | 倍率 | NA | 介质 |
|---|---|---|---|
| HC PL APO CS 10x 0.4 IMM | 10× | 0.4 | 浸液 |
| HC PL APO 20x 0.7 IMM | 20× | 0.7 | 浸液 |
| HCX PL APO CS 40x 1.25 OIL | 40× | 1.25 | 油镜 |
| HCX PL APO 63x 1.4 OIL | 63× | 1.4 | 油镜 |
| HCX PL APO 63x 1.2 WATER | 63× | 1.2 | 水镜 |
| HCX PL APO CS 100x 1.4 OIL | 100× | 1.4 | 油镜 |
2.2 调焦操作
- 硬件方式：转动调焦旋钮（粗调 + 微调）
- 软件方式：Z Position 数值框 / 滑块调节
2.3 照明模式切换转盘（四档位）
| 档位 | 标识 | 含义 |
|---|---|---|
| 1 | TL/IL | 透射光/入射光明场模式 |
| 2 | AP | 孔径光阑/相差观察 |
| 3 | INT | 干涉观察（中间镜） |
| 4 | FD | 荧光暗场模式 |
2.4 滤色块切换面板
显微镜底座控制面板：
- SHUTTER 按钮 — 光闸/快门开关，控制照明光路通断
- CUBE 1-6 按钮 — 6个荧光滤色块切换按钮，对应6种观察滤光模式
三、采集参数设置（第6-10页）
3.1 激光器配置
路径：Configuration → Laser
可用激光器及波长（表3-1）：
| 激光器 | 波长 |
|---|---|
| 405 Diode | 405 nm |
| Argon（多谱线） | 458, 476, 488, (496), 514 nm |
| HeNe 543 | 543 nm |
| DPSS 561 | 561 nm |
| HeNe 633 | 633 nm |
操作：勾选需要的激光器，通过功率滑块调节输出功率（Min ~ Max）
3.2 通道检测设置
路径：Acquire → Beam Path Setup
核心区域：
- 激光选择模块 — 选择激发激光线
- 检测通道显示区 — 多通道柱状条显示
- 光谱条 — 全光谱波长条（400-700nm），拖动滑块调节检测波长范围
- PMT 控制模块 — 每个通道的增益/偏移/激活开关
- Active 勾选框 — 激活对应 PMT 通道
- Gain（增益） — 调节信号放大倍数
- Offset（偏移） — 调节背景基线
3.3 附加通道（Additional Channels）
- PMT Trans — 透射光通道，可选模式：
- Scan-BF（扫描明场）
- Scan-DIC（扫描微分干涉）
- Scan-DICPol（扫描DIC偏光）
- Scan-Pol（扫描偏光）
- TLD-BF（透射光检测明场）
3.4 采集模式（Acquisition Mode）
按维度组合的扫描模式：
| 模式 | 维度 | 说明 |
|---|---|---|
| xy | 二维 | 单平面成像 |
| xyz | 三维 | Z轴层扫，三维重建 |
| xyt | 时间序列 | 时间序列动态成像 |
| xyλ | 光谱成像 | 波长维度扫描 |
| xyzt | 四维 | 三维+时间 |
| xyzλ | 四维 | 三维+光谱 |
| xyzλt | 五维 | 三维+光谱+时间 |
3.5 采集参数详解
| 参数 | 默认值 | 说明 |
|---|---|---|
| Format / 分辨率 | 512×512 | 图像像素尺寸，可选更高分辨率 |
| Speed / 扫描速度 | 400 Hz | 扫描速度，越高越快但信噪比越低 |
| Bidirectional X | 关闭 | X轴双向扫描，提速但需相位校正 |
| Phase correction | - | 双向扫描相位校正 |
| Zoom factor / 变焦 | 1× | 数字变焦，放大视野局部 |
| Line Average / 线平均 | 1 | 每条线平均次数，提升信噪比 |
| Frame Average / 帧平均 | 1 | 每帧平均次数 |
| Accumulation / 累积 | 1 | 图像累积次数 |
| Pinhole / 针孔 | 1 Airy | 共聚焦针孔大小，标准为1艾里斑 |
| Z-Stack / 层厚 | - | Z轴扫描范围和步数 |
像素尺寸查看路径：Configuration → Objective
3.6 不同物镜的参考参数（表3-2）
| 物镜 | 图像分辨率 | 扫描速度 | 变焦倍数 |
|---|---|---|---|
| 10× / 0.4 | 2048×2048 | 100 Hz | 3× |
| 20× / 0.7 | 1024×1024 | 200 Hz | 5× |
| 40× / 0.85 | 1024×1024 | 200 Hz | 3× |
| 63× / 1.4 | 1024×1024 | 200 Hz | 3× |
四、成像质量调节（第9页）
4.1 Smart Gain / Smart Offset
硬件操作面板旋钮：
- Smart Gain — 智能增益调节（图像亮度）
- Smart Offset — 智能偏移调节（背景基线）
- Z Position — Z轴位置调节
4.2 LUT 与 Glow Over Under 模式
- GlowOU（Glow Over Under） — 特殊查找表模式
- 灰度值 255（过曝）→ 显示为特定颜色（提示过曝）
- 灰度值 0（欠曝/背景）→ 显示为特定颜色（提示背景）
- 用于判断图像动态范围是否合适
- 调节目标：背景像素灰度值接近 0，信号不过曝
4.3 多通道串色与染料分离
GFP + Cy3 串色问题：
- 488nm 激光激发时：
- 通道1（500-530nm，GFP 通道）：采集 GFP 信号
- 通道2（560-600nm，Cy3 通道）：GFP 发射光谱漏入，造成串色
- 543nm 激光激发时：
- 仅 Cy3 被激发，GFP 通道无信号
- 解决方法：使用染料分离功能校正
操作路径：Process → Dye Separation
五、序列扫描（第11页）
5.1 序列扫描（Sequential Scan）
适用场景：多组不同参数的扫描依次进行（如不同激光/通道组合）
操作步骤：
- 在 Acquire → Acquisition 中点击 seq. 按钮
- 点击 + 添加扫描项（Scan 1、Scan 2、Scan 3…）
- 分别设置每个 Scan 的参数
- 选择切换方式：
- between lines — 行之间切换（最快）
- between frames — 帧之间切换
- between stacks — 栈之间切换
- 点击 Start 开始序列扫描
其他功能：
- - 按钮 — 删除扫描项
- Load / Save — 加载/保存序列扫描设置
六、Z轴层扫（XYZ模式）（第12-13页）
6.1 Z-Stack 操作
Z轴层扫是获取样本三维图像信息的常用方式，沿Z轴拍摄多个XY平面，堆叠形成三维数据。
操作步骤：
- 采集模式设置为 xyz（与xy模式参数设置类似）
- Z轴驱动模式选择：
- z-Galvo — Z振镜模式（高速）
- z-Wide — 宽范围Z模式（大行程）
- 找到样本目标层面
- 点击 Live 实时预览
- 调整到起始位置 → 点击 Begin 设置起始面
- 调整到结束位置 → 点击 End 设置结束面
- 停止 Live 预览
6.2 Z层扫参数
| 参数 | 说明 | 示例 |
|---|---|---|
| z-Position | 当前Z轴位置 | 12.45 µm |
| Begin | 扫描起始位置 | 12.45 µm |
| End | 扫描结束位置 | -1.15 µm |
| Nr. of steps | 总步数 | 35 步 |
| z-step size | Z步长 | 0.4 µm |
| z-Volume | 总扫描厚度 | 13.6 µm |
| system optimized | 系统优化步长 | 自动计算 |
步长和步数联动，修改一个另一个自动计算 总厚度 = 步长 × (步数 - 1)
6.3 启动扫描
- 设置好 z-step size 和 Nr. of steps（可用 system optimized 自动优化）
- 点击 Start 开始 xyz 三维扫描
- Begin / End 也可以随时调整
七、时间序列（XYT模式）（第14页）
7.1 XYT 模式原理
沿时间轴连续采集同一XY平面的图像，记录样本的动态变化过程。
7.2 操作步骤
- 采集模式切换为 xyt
- 设置成像参数（分辨率、速度等，与xy模式相同）
- 设置 Time Interval（时间间隔）
- 可精确到毫秒级（h/m/s/ms）
- Minimize 按钮：自动设置最小时间间隔
- 选择采集停止条件：
- Acquire until stopped — 手动停止
- Duration — 按总时长停止
- Frames — 按总帧数停止
- 点击 Apply 应用设置
- 点击 Start 开始时间序列采集
7.3 参考参数示例
- XY分辨率：512×512
- 扫描速度：333 Hz
- 时间间隔：2s 31ms
- 帧数：自定义
八、光谱成像（XYλ模式）（第15页）
8.1 XYλ 模式原理
同时获取样品XY平面空间信息 + 不同波长下的光谱信息，沿λ（波长）轴扫描。
8.2 操作步骤
- 采集模式切换为 xyλ
- 设置 Begin（起始波长） 和 End（终止波长）
- 设置 Band Width（带宽） — 如 10nm
- 设置 No. of steps（步数） 或 Lambda Stepsize（波长步长）
- 选择 PMT 通道（1-4通道可选）
- 点击 Start 开始光谱扫描
- 扫描完成后进行染料分离：
- 路径：Process → Tools → Dye Separation → Spectral
- 可 Save Current Spectrum 保存当前光谱
8.3 光谱扫描参数示例
| 参数 | 值 | 说明 |
|---|---|---|
| Method | Constant | 恒定步长模式 |
| Begin | 500 nm | 起始波长 |
| End | 600 nm | 终止波长 |
| Total Range | 100 nm | 总扫描范围 |
| Band Width | 10 nm | 光谱带宽 |
| No. of steps | 41 | 总步数 |
| Lambda Stepsize | 2.5 nm | 波长步进 |
步数和步长联动（锁形图标），修改一个自动计算另一个
九、数据导出（第16-17页）
9.1 实验文件格式
- .lif — 徕卡 LAS AF / LAS AF Lite 的原生实验文件格式，包含所有图像和元数据
- 文件在 Experiments 面板中以树形结构展示
9.2 右键菜单功能
右键点击图像/序列文件，弹出菜单：
| 菜单项 | 功能 |
|---|---|
| Close Experiment | 关闭实验 |
| Save Experiment | 保存实验 |
| Save All | 全部保存 |
| Save Experiment As | 另存为 |
| Create Collection | 创建收藏/集合 |
| Delete | 删除 |
| Rename | 重命名 |
| Cut | 剪切 |
| Copy | 复制 |
| Export | 导出（子菜单） |
| Properties of | 属性查看 |
| Open in new viewer | 在新查看器中打开 |
9.3 导出格式
Export 子菜单三种导出格式：
- As Tiff — 导出为 TIFF 图像
- As JPEG — 导出为 JPEG 图像
- As AVI — 导出为 AVI 视频（序列/时间序列数据）
9.4 TIFF/JPEG 导出设置
- Destination Folder — 目标文件夹（Browse 选择）
- Overlay channels — 叠加通道
- Save RAW Data — 保存原始数据
- Add quick annotations — 添加快速注释：
- Timestamp（时间戳）
- Relative timestamp（相对时间戳）
- Micron scale（微米标尺）
- Dimension data（维度数据）
9.5 AVI 导出设置
- Destination Folder — 输出路径
- Frames / sec — 帧率（如 3.0 fps）
- Overlay channels — 叠加通道
- Use compression — 使用压缩
- Add quick annotations — 快速注释（同上）
9.6 实验数据属性（Experiment Data）
查看路径：右键 → Properties of
Scanner Settings（扫描参数）可查看/导出：
| 参数 | 示例值 | 含义 |
|---|---|---|
| ScanMode | xyz | 扫描模式 |
| Pinhole [µm] | 95.5 µm | 针孔直径（微米） |
| Pinhole [airy] | 1.00 | 针孔（艾里单位） |
| Size-Width | 340.0 µm | 扫描宽度 |
| Size-Height | 340.0 µm | 扫描高度 |
| Step Size | 0.30 µm | 步长 |
| Voxel-Width | 80.1 nm | 体素宽度 |
| Voxel-Height | 80.1 nm | 体素高度 |
| Voxel-Depth | 299.9 nm | 体素深度 |
| Zoom | 1.0 | 变焦倍数 |
| Frame-Average | 8 | 帧平均次数 |
| Line-Average | 1 | 线平均次数 |
| Resolution | 8 bits | 位深 |
功能按钮：
- Apply Settings — 应用设置
- Print — 打印参数
- Save as… — 导出为 .xml 格式
- Close — 关闭
十、手册特点与注意事项
- 中文乱码问题：PDF中所有中文字符因字体嵌入问题显示为方框乱码，实际内容通过界面英文术语和操作逻辑推断还原
- 软件版本：基于 LAS AF 1.3.1 build 525，较老版本
- 操作导向：手册以”步骤编号 + 截图 + 标注”的方式编写，适合快速上手
- 覆盖全面：从开机到数据导出，涵盖共聚焦日常使用的完整流程
- 适用设备：Leica TCS SP5 系列（含共振扫描器配置）
相关笔记
- Leica-TCS-SP5激光共聚焦显微镜系统软件操作手册 — 同设备的另一版中文手册（软件默认设置+4大操作流程）
- 共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色-Leica-SP5-II — Leica SP5 II 简介及免疫荧光染色实验方法
- 徕卡TCS-SP8-STED共聚焦显微镜快速操作手册 — 徕卡新一代 SP8 + STED 超分辨系统
- Olympus-FV1000共聚焦显微镜硬件手册 — 奥林巴斯 FV1000 对比参考
- 共聚焦扫描模式参数对照表 — 6种扫描模式参数对比总表