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Nikon A1R 激光共聚焦扫描显微镜操作指南-上海科技大学

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tags共聚焦显微镜, nikon, a1r, 操作手册, nis-elements, 上海科技大学

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Nikon A1R 激光共聚焦扫描显微镜操作指南

编制单位：上海科技大学生命科学与技术学院
版本日期：2016年7月
配套软件：NIS-Elements AR
适用机型：Nikon A1R 激光共聚焦扫描显微镜（共振扫描+检流计扫描双模式）

一、仪器组成

1.1 显微镜主机（Ti-E 倒置显微镜）

序号部件说明
1滤光片组D（毛玻璃/温平衡片）、ND（减光片）、GIF（绿色滤光片+PFS红外滤光片）、NCB（色温平衡）
2视场光阑控制视场范围
3聚光器升降旋钮调节聚光器高度
4起偏器DIC 观察用
5聚光器对中旋钮柯勒照明调节
6孔径光阑控制数值孔径
7聚光器模块明视场 + DIC
8滤色块转盘含 DIC 检偏器
9手动荧光光闸荧光光路开关
10电动焦距调节旋钮电动调焦
11ND 减光片中性密度滤光
12遥控器接口Ti Pad 遥控器
13透射光电源卤素灯供电
14汞灯荧光光源目视荧光观察用（长寿命汞灯）
15PFS 控制器完美聚焦系统
16HUB 控制器显微镜通信枢纽（底座右后方，使用前必须打开）

1.2 显微镜调试常用组件

前面板控制

  • 状态显示屏
  • PFS 开关按钮
  • 光路端口切换按钮
  • 中间变倍旋钮

侧面板控制

  • 调焦旋钮（粗/微切换）
  • 物镜切换按钮
  • 滤光块/DIC 检偏切换按钮
  • 透射光光源开关
  • 透射光量度调节旋钮
  • 物镜复位
  • 物镜向下移动至最低处（约 500μm）

1.3 遥控器（Ti Pad + 长寿命汞灯遥控器）

按键功能
物镜切换按钮切换物镜
滤光块/DIC检偏器切换按钮切换滤色块和DIC检偏
DIC检偏器快速切换按钮DIC快速切换
光路端口切换按钮切换目镜/相机端口
PFS ON/OFF完美聚焦开关
聚光器转盘切换按钮切换聚光器
透射光源控制按钮透射光开关
荧光光强控制调节荧光亮度
荧光光闸荧光光路开关

1.4 软件控制

软件：NIS-Elements AR
所有控制窗口均可在 View 菜单或图像显示区右键菜单中找到。

二、开机与显微镜操作

2.1 开机顺序（三步法）

共聚焦部分（1→7）

  1. 接通激光台电源（特别注意 488nm 和 561nm 激光器的打开程序）
  2. （中间步骤略）
  3. 接通共聚焦控制器电源

显微镜部分（2→6） 2. 接通汞灯（目视荧光观察用灯）电源 → 打开约 10min 稳定，关闭后需超过 15min 才能再次启动 3. 接通卤素灯（目视透射光观察用灯）电源 4. 接通电动载物台电源 5. 接通 Piezo 快扫台（不用共振扫描时可略过） 6. 接通显微镜主体电源

计算机部分（8→9） 8. 开启计算机与显示器 9. 启动 NIS-Elements 软件（确保上述开机完成后才能打开软件）

2.2 三种观察模式

（1）明场观察

  • 打开透射光卤素灯电源
  • 滤色块移到空位
  • 起偏器、检偏器移出光路
  • 聚光器切换到 A 状态
  • 检查出光端口

（2）微分干涉（DIC）观察

  • 按明场方法调节好显微镜
  • 起偏器、检偏器移入光路
  • 聚光器转到对应 N1/N2 位置（参见物镜-DIC 对照表）
  • 旋转起偏器选择最佳显示效果

（3）荧光观察

  • 打开荧光电源，等待约 10min 至稳定（光源指示灯不闪）
  • 关闭透射光
  • 选择合适滤色块
  • 打开光闸，调节荧光亮度
  • 不观察时关闭光闸，避免荧光淬灭

三、共聚焦图像拍摄

3.1 共聚焦光路调节

调出界面： 右键灰色空白处 → [Acquisition Controls] → [A1plus Compact GUI]

探测器类型：

  • [DU4]：标准探测器
  • [SD]：光谱探测器（Spectral Detector）
  • [VF]：虚拟滤色片（Virtual Filter）

注意：光谱探测和虚拟滤色片模式下，只有检流计式（Galvano）扫描可用，无法切换到共振扫描。

通道交替设置：

  • 同时打开所有激光（速度快，可能串色）
  • 顺序打开一个激光器（防串色，速度慢）

光路配置（OC / Optical Configurations）：

  • 可选择预设 OC 快速应用成像条件
  • 可通过 Camera Settings 新建 OC
  • 选择染料/荧光蛋白 + 是否拍明场
  • Setting 按钮打开 Optical path 窗口配置：探测器、二向色镜、通道、染料、激光

3.2 XY 图像拍摄

拍摄流程（8步）：

  1. 选择扫描方式：共振（Resonant）或检流计（Galvano）

    • A1R 系统同时含两种模式
    • 光谱/虚拟滤色片模式下仅有检流计式

  2. 选择激光/通道

  3. 设置针孔（Pinhole）：选择激光波长 → 点击按钮自动匹配物镜的针孔尺寸

  4. 实时预览调节：点击 [Scan] 按钮 → 调节：

    • Laser：激光功率（鼠标滚轮精细调节）
    • HV：探测器灵敏度（高压）
    • Offset：信号偏移（标准值：0）

  5. 设置像素分辨率：图像暗时降低扫描速度

  6. 设置平均（Average）：根据需要降噪

  7. 拍摄图像：点击 [Capture] 按钮

  8. 保存图像：[File] → [Save As]

图像显示调节：LUTs 窗口进行细致调节

扫描区域调节（Scan Area）：

  • 拖动绿色边框缩小扫描区域
  • 十字箭头移动边框 → 右键确定位置
  • Zoom 确认缩放倍率
  • 旋转范围：-90°～+90°
  • 旋转点拖动设置旋转角度

3.3 XYZ 图像拍摄（Z 轴序列）

  1. 点击左侧工具栏 Capture Z Series 按钮，启动对话框
  2. 点击 [Defined top & bottom] 按钮
  3. 点击 [Reset] 按钮
  4. 点击 [Scan] → 边观察图像边转动调焦手轮（微调模式）→ 点击 [Top] 定顶面
  5. 点击 [Scan] → 同样方法定 [Bottom]
  6. 设置 Step（步长）
  7. 可选 [Save to File]（边拍边存）
  8. 参照 3.2 设置拍摄参数
  9. 点击 [Run now] 开始采集

3.4 XYT 图像拍摄（时间序列）

  1. 点击 Capture Timelapse 按钮
  2. 设置时间间隔（Interval）和持续时间（Duration）
  3. 可选 [Save to File]
  4. 参照 3.2 设置拍摄参数
  5. 点击 [Run now] 开始采集

3.5 大图拍摄（拼图 / Large Image）

菜单位置：[Acquire] → [Scan Large Image]

设置步骤：

  1. 设定扫描范围
  2. Z Series 设置
  3. 图像重叠补偿
  4. 阴影补偿开关
  5. 多通道拍摄参数
  6. Focus 对焦方法
  7. 保存方法
  8. 保存路径和格式
  9. 点击按钮获取大图

3.6 ROI 荧光强度扫描（时间测量）

  1. 打开经时序列图像程序
  2. 右键灰色区域 → [Analysis Controls] → [Time Measurement]
  3. 在图像上设定 ROI：
    • 点击 [Define] → Define ROI 窗口
    • 在图像上绘制 ROI → [Finish]
  4. 经时变化分析：
    • 点击 [Measure] 绘制图表
    • Multi ROIs 模式：多个 ROI 的经时变化（每次选 1 个通道）
    • Multi Dyes 模式：多个通道的经时变化（每次选 1 个 ROI）
    • [Export] → Export Data 保存为文本数据

3.7 多点序列扫描（ND Acquisition）

  1. 点击 ND Acquisition 按钮
  2. XY 选项卡：设置多点位置
    • 电动载物台摇杆移动到目标点（边看 Live 图像边移动更方便）
    • 点击 Point Name 登录位置
    • 可选 Include Z 同时登录 Z 位置或 PFS 偏移值
    • 重复登录所有需要的点
  3. Time 选项卡：设置 Interval 和 Duration
  4. 可选 [Save to File]
  5. 参照 3.2 设置拍摄参数
  6. 点击 [Run now] 开始采集

XYZ Overview 面板：高级载物台与 Z 轴控制（右键 → Acquisition Controls → XYZ Overview）

四、图像保存与处理

4.1 图像保存

图像三层结构：

  • 注释层：保存注释、测量信息
  • Binary 层：二元阈值分析
  • 图像层：不同位深的原始图像

文档类型：

  • RGB 图像：彩色相机格式
  • 多通道图像（Multi-channel）：多通道单幅
  • Nd2 多维图像：含时间/Z轴/多点/多通道

保存格式：

  • jp2000：单幅图像默认格式
  • nd2：多维图像默认格式（含所有拍摄条件信息）
  • 导出格式：tif / jpg / bmp / gif / png / avi

⚠️ 重要：保存前先保存原始格式（nd2/jp2000），原始格式包含所有拍摄条件信息。

  • 查看拍摄信息：图像上单击右键 → image property
  • 复用拍摄条件：图像上右键 → reuse camera settings
  • 在 Office 软件中查看：Image 菜单 → convert → 转 8位 RGB → 另存为 tif/jpg

图像查看工具（General Control）：

序号工具功能
①探测框光强柱状图、自动曝光、自动白平衡
②背景框参考区域背景扣除（Image > Background > Subtract Background）
③网格粗略距离查看
④标尺加标尺；导出时用 Burn Scale 功能
⑤测量框选择测量范围
⑥ROI 选择感兴趣区域
⑦路径光强分析View > Analysis Control > Intensity Profile

以上按钮均可右键详细设置。

通道控制：

  • 拖出通道 = 得到单通道图像
  • 拖入通道 = 合并通道
  • 通道颜色：通道位置右键 → channel property 对话框修改

4.2 图像分析

（1）ROI Statistics（感兴趣区域统计）

  • 工具：矩形 / 椭圆 / 自由曲线模式
  • ROI 编辑：ROI Editor 菜单修改
  • 结果：面积、平均光强、总光强、信噪比等

（2）Thresholding（阈值分析）

  • 生成 Binary 图层进行分析
  • 模式：RGB / HSI / MCH（单通道）/ Intensity（亮度）
  • 工具：
    • 阈值选取工具（加入阈值范围）
    • 手动阈值范围输入
    • 清除碎片 / 平滑边缘 / 形态学分割
    • 目标筛选（大小、周长、亮度）
    • 查看结果：Analysis → ROI Statistics → Binary 栏
  • 提示：Binary 菜单下 Fill in holes / 膨胀 / 腐蚀 / 打开 / 封闭 / 形态学分割等修正工具

（3）Binary Edit（二元蒙板层编辑）

  • 快捷键：Tab 键 或 Binary 菜单 → Binary Edit
  • 前景（FG）/ 背景（BG）编辑
  • 填充、切割、增加/修改目标区域

（4）Object Count（目标计数）

  • 同 Thresholding 选择目标
  • 自动计算目标数量
  • 每个目标：面积、平均光强、周长等特征
  • 可对整个 ND 文件逐帧分析
  • 输出格式：txt / Excel
  • 统计数据在 ROI Statistics 的 Binary 栏查看

（5）Annotations and Measurements（标注和手动测量）

  • Annotations 栏：箭头、直线、矩形、椭圆、文字、折线、自由曲线
  • Measure length 栏：两点距离、平行线距离、折线路程、对角线、自动边缘检测
  • Area 栏：曲线/矩形/椭圆 ROI 面积测量
  • 附加：圆/半径/半轴长测量、手动计数、分类
  • 所有结果可导出到本地

（6）Time Measurement（时间测量）

  • 在时间序列图像上选 ROI
  • 选择 Measure 测量
  • Multi ROIs：多个 ROI 区域的时间变化
  • Multi Dyes：多个通道的时间变化
  • 输出：图表 / 数据表格（Export 选择）

附录

附录一：显微镜光路调节和照明注意事项

（一）柯勒照明调节方法

  1. 选择 10× 物镜
  2. 调焦使标本清晰
  3. 缩小视场光阑
  4. 上下调节聚光器使视场光阑边缘清晰
  5. 调节聚光器对中旋钮使其居中
  6. 放大视场光阑使其刚刚外切于视野

（二）长寿命汞灯电源注意事项

  • 打开后约 10min 光源稳定
  • 关闭后至少等 10min 才能重新打开

（三）物镜盖玻片矫正环调节方法

  1. 调焦使图像最清晰
  2. 矫正环向一个方向转动一定角度 → 图像变模糊 → 重新调焦到最清晰
  3. 判断图像质量是否改善
  4. 有改善则同向继续旋转；质量下降则反向旋转
  5. 重复直到找到最佳位置（图像质量改善后又下降的前一个位置）

附录二：Ti-E 物镜 / DIC 插片 / DIC 棱镜对照表

物镜DIC SliderN1/N2
Plan Apo 10×10×N1
Plan Apo VC 20×20×N2
Plan Apo 40×40×N2
Plan Apo VC 60×60×N2
Plan Apo VC 100×100×N2

附录三：图标工具栏速查

图标功能图标功能
Open打开文件Z Stack LiveZ轴序列预览
Save保存Integrate叠加（多次累积）
Save next另存新文件Average平均（多次平均降噪）
Print打印Capture to RAM Buffer拍摄存至缓存
Undo撤销Binary Toolbar二元蒙板编辑
Redo重做Capture Multichannel拍摄多通道
Live Fast快速预览Capture Multipoint拍摄多点
RAM Buffer ON内存拍摄Copy复制
Background Correction ON背景校正Paste As New Image粘贴为新图像
Optical Configurations光路配置Crop剪切
New Optical Configuration新建光路Run Macro执行宏
Pointing Tool指针Close All关闭全部窗口
Magnifier Glass放大镜General Option设置
Annotations & Measurement注释测量Customize Toolbar自定义工具栏

多维拍摄窗口：

  • Define/Run Experiment：打开多维拍摄窗口
  • Capture Time Lapse：时间序列
  • Capture Z Series：Z轴序列

附录四：控制窗口分类

Acquisition（采集）：

  • ND Acquisition、AVI Acquisition、Auto Capture Folder
  • Camera Settings、Capture FRET Image
  • Filters and Shutters、Lamp
  • Nosepiece、Microscope Control Pad、XYZ Navigation、Z Series

Visualization（可视化）：

  • Binary Layers、Histogram、LUTs
  • Opened Images、Preview、Synchronizer、XY Overview

Analysis（分析）：

  • Annotations and Measurements
  • Automated Measurement / Results
  • Binary Toolbar
  • Colocalization（共定位）
  • EDF Z-Profile（景深扩展）
  • Intensity Profile（光强分析）
  • Object Count / Classifier
  • Pixel Classifier

附录五：图像格式批量转换

用途：批量将 nd2 等格式转为 tif/jpg，便于在 Windows 或其他软件中编辑。

步骤：

  1. 备份文件到新文件夹（转换会改变原始图像）
  2. File / Sequences / Play Sequences
  3. 左侧选择目标文件夹
  4. Play Mode 选：Open images to full screen 或 Don’t load images, use commands
  5. 点击 Execute Commands 右侧图标 → Paste Commands 窗口
  6. 选 Macro → RunMacro(…) → 指定 8bitRGBsave.mac 宏文件 → OK
  7. 点击 Play → 自动处理 → 按 Enter 退出
  8. File / Sequences / Convert files Directories → output 选保存文件夹 → format 选 tiff/jpeg → OK

8bitRGBsave 宏 = 转8位 + 转RGB + 保存。软件版本不同界面稍有差异。

关键注意事项汇总

  1. 开机顺序：激光台 → 显微镜 → 计算机 → 软件（软件最后开）
  2. 汞灯保护：开启后10min稳定，关闭后10min才能重开
  3. 荧光淬灭：不观察时立即关闭荧光光闸
  4. 原始数据：先存 nd2 原始格式，再导出其他格式
  5. LUT 警告：应用 LUT 按钮会改变原始荧光强度，测量前勿按
  6. 通道操作：拖拽可拆分/合并通道
  7. PFS 完美聚焦：长时间拍摄建议开启
  8. A1R 双扫描模式：共振（快）+ 检流计（光谱模式下仅检流计可用）

相关笔记

关系图谱

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