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Nikon Eclipse Ti A1-A 共聚焦显微镜操作手册 - BRCF/MIL

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Nikon Eclipse Ti A1-A 共聚焦显微镜操作手册（BRCF/MIL）

来源：BRCF（Biomedical Research Core Facilities）/ MIL（Microscopy & Image Analysis Laboratory），Nikon Eclipse Ti A1-A 共聚焦显微镜操作手册。10 页英文操作指南，面向用户的快速操作协议。

一、开机流程（Start-up）

  1. 开启 Excite 荧光光源电源（金属卤化物灯）
    • 冷却方式同汞灯
    • 光轮关闭——液体光导
  2. 打开电源排插：开启透射光、载物台控制、显微镜
  3. 开启 Nikon A1 控制器（共聚焦控制盒），等待指示灯停止闪烁并变绿
  4. 打开激光器电源排插
  5. 打开每个要用的激光器钥匙开关
  6. 打开电脑和显示器
  7. 登录：使用 uniquename + Level 1 Kerberos 密码
  8. 启动 NIS-Elements 共聚焦软件
    • 注意：显微镜必须先初始化再启动软件
    • 选择屏幕亮度（暗/亮）
    • 排列控制面板：Ti Pad（显微镜控制）、A1 Plus GUI、A1 Plus Scan Area
    • 面板缺失时：右键桌面 → Acquisitions Control → A1 Plus GUI / A1 Plus Scan Area / TiPad

二、显微镜操作（Microscope）

2.1 物镜与载物台

  • 塔台后倾：方便接近载物台
  • 物镜切换三种方式：
    1. 手动旋转
    2. 镜基左侧拨动开关
    3. 软件 Ti Pad 控制
  • 物镜配置：
    • 10× 干镜
    • 20× 水/甘油/油（校正环需对应设置）
    • 40× 油镜
    • 60× 油镜
  • 装片：仅移动载物台插片的左侧滑块

2.2 滤色块

  • 五种滤色块（右侧拨动开关或 TiPad 控制）：
    1. DAPI
    2. FITC/GFP
    3. TxRed
    4. Analyzer（DIC 用）
    5. A1（共聚焦用）
  • 镜基正面有显示屏，显示当前滤色块和物镜
  • 荧光光源：Excite 电源上的光轮控制开合，不用时关闭
  • 镜基右侧快门按钮不可用

2.3 调焦与载物台

  • 三种调焦方式：
    1. 镜基旋钮（粗调/微调/超微调）
    2. 载物台控制旋钮（粗调/微调/超微调）
    3. 软件鼠标滚轮
  • 载物台移动：操纵杆控制，旋转操纵杆切换粗/细/超精细
  • Z 轴清零：按镜基正面 Reset 按钮，将 Z 读数设为 0（工作位置）
  • 装载位置：按右侧 Escape 键切换到装载位，按 up 键返回工作位（装载位无法调焦）

2.4 透射光

  • 软件 TiPad 中开启卤素灯：
    1. 点击 DIA 矩形（绿变红）
    2. 点击黄点
    3. 用滑块调节亮度

三、共聚焦成像（Confocal Imaging）

3.1 切换到共聚焦模式

  1. 点击顶部工具栏灰色 A1 按钮（首次打开软件时只点一次，多次点击会导致软件异常）
    • 将光路切换到左侧共聚焦扫描盒
    • 如未切换，手动按镜基正面 L100 按钮
    • 滤色块转塔移至 A1 位置（空）
  2. 点击 REMOVE INTERLOCK（解除安全联锁，激光才能通过。只点一次，有延迟）
  3. 打开 A1 Plus Scan Area 面板，放在 A1 Plus GUI 旁边对照
    • Scan Area 显示光学切片厚度，GUI 不显示

3.2 通道设置

  1. 在 A1 Plus Compact GUI 中勾选/取消勾选需要的通道
  2. 点击 Settings 图标（彩虹齿轮）：
    • 修改通道名称：点击 Auto → 下拉列表选择
    • 设置伪彩色：点击颜色框 → 调色板选择
    • 查看光路和滤色片示意图
    • 取消不需要的通道
    • 按 OK 确认

3.3 扫描参数设置

  • 扫描方式：Single Directional（单向）
  • 控制方式：Frame Per Second（帧/秒）
  • 扫描速度：1/2 frame per second
  • 分辨率：1024×1024
  • 模式：Normal（非 Kalman）
  • 通道扫描：Ch Series（顺序扫描，减少串色）

3.4 针孔调节

  • 选择针孔计算用的通道（所有通道共用同一针孔大小）
    • 建议选中间波长（如 488nm 计算的 AU）
  • 按 AU 按钮可直接设为 1 Airy Unit
  • 或手动调节针孔滑块，在 A1 Plus Scan Area 中读取光学切片厚度

3.5 成像参数优化

  1. 确保各通道 HV 滑块在中点以下，防止过饱和和损坏 PMT
  2. 各通道激光功率预设为 3%，根据样品上下调整
  3. 按 Scan 扫描，鼠标滚轮调焦找到最亮焦平面
  4. 按 AG（Auto Gain）：软件自动采样几组 HV/Offset 设置，选择最佳值，出现合并图像
  5. 手动优化各通道光强（步骤 13）

3.6 范围指示器（Range Indicator）

  1. 图像切换为灰度：右键图像左下角通道 → channel color → mono
  2. 顶部工具栏开启 Range Indicator
  3. 下拉选择饱和像素颜色（如红色）
  4. 下拉选择黑色/偏移像素颜色（如蓝色）

3.7 各通道光强优化

  1. 关闭其他通道，只留一个
  2. 按 Scan
  3. 鼠标悬停 HV 控件，滚轮调节强度
  4. 鼠标悬停 Offset 控件，滚轮调节黑电平
  5. 切换到下一个通道，重复操作

3.8 积分与采集

  • 积分模式：点击积分图标，从 Normal 切换到 Integrated，下拉选择积分次数（如 4 或 8 次）
  • 采集图像：点击采集图标获取最终图像

四、保存方法

4.1 单平面图像保存

方式一：ND2 格式（推荐，保留元数据）

  • File → Save As
  • 路径：User folder → 个人姓名文件夹 → 日期子文件夹
  • 格式：ND2 Image File Format (*.nd2)
  • 保存所有通道（或选定通道）

方式二：单通道 TIF（用于 Photoshop）

  • File → ND → Export ND Document
  • 格式：Tif
  • 选择 Color Image for Each Channel
  • 勾选 LUT
  • 点击 Export（软件自动添加通道后缀）

方式三：合并图像 TIF

  • File → Import Export → ND Export to Tiff
  • 格式：Tif
  • 选择 Merged color image
  • 勾选 LUT
  • 勾选 convert 12 bit to 8 bit
  • 点击 Export

方式四：屏幕快照（分辨率略低）

  • 按键盘 x 键：截取显示画面并自动转为 8bit
  • File → Save As → Tif 格式保存

方式五：多通道面板显示保存

  • 设置好所有通道+合并图的显示布局
  • 按 x 键快照 → 保存为 Tif

4.2 标尺添加

  1. 图像右侧选择标尺图标
  2. 下拉箭头 → Properties
  3. 设置线宽、颜色、字体
  4. 选择是否 Burn into image（烧录到图像中）

五、Z-Stack（Z 轴层扫）

5.1 设置步骤

  1. 打开 ND Acquisition 面板（右键桌面 → Acquisition Controls → ND Acquisition）
  2. 取消勾选 “Save to File”（避免重复保存）
  3. 取消 time 等模式，只勾选 Z
  4. 定义 Z-Stack 上下边界：
    • 切换到 Normal 扫描模式
    • 按 Scan → 鼠标滚轮找到上边界 → 点击 Top
    • 鼠标滚轮找到下边界 → 点击 Bottom
    • 停止扫描
  5. 步长设置：输入步长值，或按 Optimum 按钮（1/3 重叠）
  6. GUI 中设置 Kalman 次数（如 2x）
  7. 点击 Run Now 开始采集

5.2 Z-Stack 保存

  1. ND2 格式：File → Save As → ND2 格式
  2. 单层面单通道 TIF：同单平面 TIF 方法（文件数量多）
  3. 合并层面 TIF：
    • 显示设为合并图像
    • Image → Convert → 8 bit RGB（检查底部确认）
    • File → ND → Export ND Document
    • 选 Channels Merged Into One Color Image → 勾选 LUT → Export

六、DIC 成像

  1. 开启透射光：TiPad 中开启
  2. 建立 Kohler 照明：
    • 对焦 → 明视野（聚光镜转塔 A 位）→ 关闭视场光阑 → 聚焦使光阑边缘清晰 → 打开视场光阑至边缘接近视场边缘 → 聚光镜平移旋钮居中 → 打开至边缘刚出视场
  3. 切换到 DIC 配置：
    • 推入顶部偏振滤光片
    • 聚光镜转塔转到 DIC N1（10×）或 DIC N2（20×及以上）
    • 显微镜滤色转塔选 DIC
    • 旋转顶部偏振片优化 DIC 效果
    • 关闭透射光
  4. 切换到共聚焦模式：
    • 点击 Eyeport
    • Settings → Auto → DIC Transmitted Detector（DIC 探测器移入光路）
    • 扫描 → HV 和 Offset 优化 DIC 图像

七、关机流程（Shut Down）

  1. 退出软件：File → Exit（这样保存控制面板布局，方便下一位用户）
  2. 转移图像：复制到 M+Box 或加密 USB 盘
  3. 载物台降至装载位：镜基右侧 Escape 按钮
  4. 取下载玻片
  5. 清洁油镜：用镜纸擦拭浸油物镜
  6. 物镜转塔旋至空位
  7. 升起物镜塔到工作位
  8. 检查预约系统：看下一位用户，关闭不用的激光器
  9. 最后一位用户：按开机逆序关机 6. 关电脑和显示器 5. 关激光钥匙 4. 关激光电源排插 3. 关 Nikon A1 控制器 2. 关电源排插 #2
    1. 关 Excite 金属卤化物电源

八、相关笔记

关系图谱

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