Nikon A1R MP 共聚焦显微镜培训手册
培训手册作者：Karl Ferdinand Ziegler，2017-11-27 版，19 页。 设备：Nikon A1R MP 共聚焦激光扫描显微镜（配备多光子 Multiphoton 模块） 软件：NIS Elements
一、开关机流程
开机顺序（1→7，顺序很重要）
- 激光器电源（Power supply for Lasers）
- 激光钥匙开关（Key switch for laser）
- 电源控制单元（Power supply control unit）
- 金属卤化物灯（Metal halide lamp，落射荧光用）
- 卤素灯泡（Halogen bulb，透射光明场用）
- 电动载物台电源（Power supply motorized stage）
- 显微镜电源（Power supply for microscope）
关机顺序
完全反向：7→1（先关显微镜，最后关激光器电源）
二、样品查找（三种方式）
2.1 明场观察（Brightfield，无 DIC）
- 开机后不启动软件
- 选择物镜，确保清洁并滴好油/水
- 放置样品
- 确认滤光片不在光路中（Panel A）
- 打开透射光按钮，调节强度旋钮（Panel C）
- 将滤光片转盘切换到空位（Panel D/E）
- 用目镜找样品
- 载物台控制（Panel F）：
- 旋钮 [1] 旋转 → 改变 XY 移动速度
- 旋钮 [1] 平移 → XY 方向移动
- 按钮 [2] → 改变 Z 移动速度
- 旋钮 [3] 旋转 → Z 方向移动
注意：对比度不够时用 DIC；减少光漂白要及时关灯，用最低必要强度。
2.2 DIC 微分干涉（高对比度）
在明场基础上替换第6-7步：
- 起偏器（Polarizer, Panel B）推入光路
- Wollaston 棱镜就位（Panel C）
- 物镜下方另一个 Wollaston 棱镜（Panel D）
- 滤光片转盘切到检偏器（Analyzer, Panel E/F）
- 旋转起偏器调节 DIC 对比度（Panel G）
注意：20x 和 60x 物镜配 Wollaston 棱镜；40x 等其他物镜需咨询平台管理员。
2.3 落射荧光（Epi Fluorescence）
- 明场步骤 1-4 相同
- 打开金属卤化物灯快门（Panel B 旋钮 I），调节强度（旋钮 II）
- 滤光片转盘切换到 DAPI / FITC / TxRed 滤光片（Panel C/D/E）
- 用目镜找样品
注意：DIC 在此模式下不可用；尽量减少光照以防光漂白。
三、共聚焦软件操作（NIS Elements）
前提条件
- 样品已聚焦
- 透射光已关闭（减少光漂白）
- 金属卤化物灯快门已关闭
3.1 软件启动与预设
两种配置方式：
- a) 选择光学配置（Optical Configuration）：如 “A1-488-561-640 TD”
- b) 打开已有图像 → 右键 → Reuse camera settings（复用相机设置）
界面三大区域：
- LUTs：查看当前强度值和缩放
- General Acquisition settings：扫描速度、激光功率等
- Optical Zoom：光学变焦（放大倍率↑，视野↓）
3.2 采集参数设置与 2D 成像
核心参数调节
| 参数 | 位置 | 效果 |
|---|---|---|
| 光源选择 | Panel A, 按钮1 | 488nm（绿）/ 561nm（红）/ 638nm（蓝）/ 透射光 |
| Interlock 解除 | Panel B, 按钮1 | 红色时按下解除；需确认 L100 物镜已选 |
| Scan / 激光开关 | Panel B, 按钮2 | 实时扫描/冻结图像 |
| 增益 Gain (HV) | Panel A, 区域2 | 增加信号同时增加噪声 |
| 扫描速度 | Panel B, 区域8 | 降速→信号↑但光漂白↑ |
| 激光功率 | Panel A, 区域4 | 增加→光漂白显著增加 |
| 图像像素尺寸 | Panel B, 区域9 | 标准 512 或 1024 |
| 扫描模式 | Panel B, 区域4 | Galvano（标准）/ Resonant（共振，更快更噪） |
| 扫描方向 | Panel B, 区域6 | 单向 / 双向（速度翻倍但噪声增加） |
| 平均 Averaging | Panel B, 区域10 | Normal / Line / Integral，降噪但变慢 |
| 针孔大小 | Panel B, 区域12 | 推荐 1.2 AU（波长相关） |
| Capture 拍照 | Panel B, 按钮13 | 采集最终图像 |
信号强度目标
- LUT 强度值应保持在 2000–3000 之间
- 避免像素饱和
- 三个参数（增益/速度/激光功率）需平衡取舍
其他实用功能
- Eye Port 按钮：关闭激光和探测器，切换到目镜观察（再按恢复）
- 扫描速度单位：推荐用 Frame/sec
- 实时帧率：Panel B 区域 11 显示 fps 和帧时间
- 减少光漂白：尽量冻结图像（激光关闭）
- 图像缩放：Auto scale 自动 / 手动调节
3.3 光学变焦与移动视野
- 在变焦区域（Panel A 区域1）输入值、拖动滑块或用鼠标框选
- 绿色框变红后 → 右键确认 → 变回绿色
- 可拖拽移动整个视场（建议保持在扫描区域中心，不要移到角落）
- 右键某点 → Move this Point to Center：将该点移到视野中心
3.4 Z-Stack 三维成像
操作步骤
- 设置好 2D 参数和视野后，按 Z-Stack 按钮
- 选择保存路径和文件名
- 只勾选 Z（取消其他）
- 三种定范围方式：
- 方式一（手动上下限）：找到底部按 Bottom，找到顶部按 Top，设置步长或步数
- 方式二（对称厚度）：输入总厚度，当前位置为中心
- 方式三（非对称厚度）：分别输入下方和上方厚度
重要注意事项
- 步长/步数二选一，软件自动换算
- Z 设备选 Ti ZDrive
- 务必勾选 “Close active Shutter during Z Movement”（Z 移动期间关闭快门，减少光漂白）
3.5 不同视图模式
| 视图 | 说明 | 要求 |
|---|---|---|
| Slice View | XY + XZ + YZ 正交投影视图 | 需要 Z 或 T 维度 |
| Volume View | 3D 体积渲染模型 | 需要 Z 维度 |
| Tiled View | 平铺显示各帧（拼图） | 需要 Z / T / XY 维度 |
3.6 比例尺（Scale Bar）
- 图像右侧按钮添加
- 可选垂直或水平
- 可烧录到图像中或移动位置
3.7 数据保存
用于分析（For Analysis）
- 格式：ND2（Nikon 原始格式）
- 保存内容：图像原始数据 + 显微镜配置参数
- 特点：可复用相机设置，可后续重新分析；文件较大，不适合邮件发送
用于邮件发送
- 将图像窗口置顶
- 两种方式生成图像：
- Edit → Create Full View Snapshot (8bit RGB)
- 快捷键 Shift + Z
- File → Save as → 选择 TIFF 格式
- 根据需要勾选合并选项
四、多光子成像（Multi Photon / MP）
⚠️ 重要警告：使用多光子前必须关闭室内灯光并关门，否则会损坏探测器！
4.1 单色多光子
- 按 MP 按钮切换到多光子模式
- 系统自动配置，所有激光源波长变为 800nm
- 只留一个通道勾选（其他取消），可调 HV 和激光功率
- 右键黑屏 → Acquisition Controls → A1 MP GUI 打开多光子控制面板
- MP GUI 操作：
- On 按钮：开启发射激光（黄灯=预热，绿灯=就绪）
- Shutter 按钮：左黄（开）/ 右灰（关）控制激发快门
- Wavelength：激发波长调节，范围 700–1000 nm
- Auto：激光对准选自动
- 设置扫描速度、图像大小等 → Scan / Capture 采集
4.2 多色多光子
方法一：单波长同时激发（最快）
- 每个荧光团勾选对应通道，独立调节 HV
- 缺点：无法为每种荧光团使用最佳波长，需要折中
- 优点：速度最快
方法二：多波长顺序扫描（质量更好）
- Calibration → Optical Configuration（或 Ctrl+N）
- 左侧 MP → Duplicate（复制），命名如 MP-green-xxx、MP-red-xxx
- 对每种颜色单独设置：波长、功率、增益等
- 保存：右键光学配置 → Assign current camera setting
- 打开 ND Acquisition Wizard（ND 采集向导）
- 只勾选光学配置维度，添加所有配置
- 可用箭头调整顺序
- 按 Run Now 开始
4.3 多色 + Z-Stack 组合
- 分别设置 Z-Stack 和多色 MP
- 关键优化：确保 Z-Stack 符号在左侧、多色在右侧（先扫完一个波长的全部 Z 层，再切下一个波长）
- 如果顺序反了，系统每层 Z 都要切换波长，速度极慢
多光子推荐物镜
- Plan Fluor 20x MI
- APO Lambda S LWD 40x WI
- Plan APO IR 60x WI
离开实验室前：务必将显微镜切回共聚焦模式（顶部切换），探测器会自动切换。
五、故障排除
设备无法识别（软件启动报错）
- 关闭软件 → 等 30 秒
- 关闭控制单元（开机步骤第3步）→ 等 1 分钟
- 确认其他 6 个电源开关都开着（除了控制单元）
- 如果不是：按开机顺序依次打开（除控制单元外）
- ⚠️ 不要全部关掉
- 等 1 分钟
- 打开控制单元 → 等 1 分钟
- 启动软件
如果问题仍在，联系设备管理员 Andy Schaber 或 Ferdinand Ziegler。
金属卤化物灯注意事项
- 关闭后至少等 15 分钟才能重新打开，否则会损坏光源
- 没有金属卤化物灯也能用软件，只是不能用落射荧光找样品
关键要点速查
| 项目 | 推荐值/操作 |
|---|---|
| 针孔大小 | 1.2 AU |
| LUT 强度目标 | 2000–3000 |
| 图像像素 | 512 / 1024 |
| 多光子波长范围 | 700–1000 nm |
| 保存格式（分析用） | ND2 |
| 保存格式（邮件用） | TIFF（8bit RGB 快照） |
| 光漂白防护 | 及时冻结图像/关灯 / Z 移动关快门 |
| 扫描速度权衡 | 慢=好信号但多漂白 |
| 多光子安全 | 必须关灯关门 |