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Nikon A1R 共聚焦显微镜快速操作指南 - 伦敦国王学院 NIC

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Nikon A1R 共聚焦显微镜快速操作指南

来源：Nikon Imaging Centre (NIC) @ King’s College London 设备：Nikon A1R 共聚焦显微镜 + Ti 倒置显微镜 定位：cheat sheet（速查表/快速操作指南），10 页精炼操作步骤 软件：NIS Elements + A1 扫描控制模块（A1 Compact GUI / A1 Scan Area / ND Acquisition）

一、开机流程 (Start-up)

1.1 系统组成

编号组件说明
1激光器钥匙开关旋转钥匙开启激光
2快门控制盒 (Shutter control box)控制各类快门
3——
4显微镜开关主机电源
5探测器开关检测器电源
6荧光灯 / 透射光宽场照明
7XY 载物台 / 温控 / CO₂活细胞实验用
8操纵杆 (Joystick)XY 移动 + Z 调焦轮
9Epi 快门 / 滤光片切换 / 物镜切换光路控制
10明场快门 / 明场强度透射光控制

1.2 开机步骤

  1. 依次开启所有编号组件，确认 piezo Z 驱动已通电
  2. 活细胞实验：打开 CO₂ 钢瓶并调压，开启温度控制
  3. 用操纵杆移动载物台——顺时针旋转变精细、逆时针变粗调；侧边调焦轮控制 Z，按 Z speed 按钮切换 Z 速度
  4. 物镜配置：干式（4×、10×、20×、40×）和油镜（60×、100×）。40× 物镜校正环默认设为 0.17（标准 #1.5 盖玻片）
  5. 油镜使用前用镜头纸+乙醇清洁

⚠️ 警告：请勿使用 escape 和 refocus 按钮。如果物镜预设位置过高，物镜可能撞上玻片架造成损坏。

二、目镜观察 (Eye Pieces)

四大操作模块：Ti Pad、A1 Compact GUI、A1 Scan Area、ND Acquisition。 右键软件界面 → Acquisition controls 可调出更多选项。

目镜观察步骤

  1. 在 A1 Compact GUI 窗口点击 Eye port，将光线导至目镜
    • Ti Pad 上应显示：光路 E100、Turret 1 滤光片塔在非空位
  2. 对焦并切换滤光片检查各通道；对焦后关闭 Epi 快门避免样品淬灭

三、共聚焦图像采集 (Recording a Confocal Image)

3.1 基础设置

  1. 再次点击 Eye Port 关闭目镜光路，光线进入共聚焦探测器
    • 光路选 L100，按下 remove interlock 解锁
  2. 选择 DU4 模式（最多 4 个探测器）
  3. 初始扫描推荐参数（figure 12）：
参数推荐初始值说明
扫描类型Galvano（normal）普通振镜扫描
Pixel dwell2.2 μs像素驻留时间，越高则越亮但越慢、淬灭越重
图像大小512×512快速预览用
平均/积分Normal（无）无帧平均
Ch Series开启，[4]→[1]通道顺序
Pinhole1.0 AU标准共聚焦针孔，消除焦外光

3.2 通道设置 (Channel Settings)

每个通道独立控制激光功率和探测器参数：

参数初始值说明
HV（增益）100探测器灵敏度，过高（>120）引入噪声
Offset（偏移）0基线强度；零信号区应落在直方图零位；可设负值以扣除背景，最大化动态范围
Laser Power3%绿/红通道配 GaAsP 高灵敏度探测器，可用低激光功率减少淬灭

3.3 图像采集步骤

  1. 减少淬灭：单独调节每通道时关闭其他通道的激光
  2. 点击 Scan 实时扫描并用鼠标滚轮调焦
    • 鼠标滚轮可在缩放 / Z 轴调节两种功能间切换
    • 启用 Z 轴：Devices → Enable mouse joystick Z in live
    • 步长设置：Mouse joystick setup
  3. 针孔设置：按最长波长通道计算 AU 值，确保所有通道光学切片厚度一致且不小于 1AU
  4. XY 移动：选 mouse XY 按钮，按住左键拖动
  5. 像素饱和指示：图像顶部开启，设过饱和/欠饱和颜色（如洋红色=过饱和）
    • 过饱和：像素强度超过 12-bit 上限（4095），需降低 HV 或激光功率
    • 欠饱和：像素为零，可能需设负 offset 扣除背景
  6. A1 Scan Area 窗口：缩放、旋转、Nyquist XY 选项
    • Nyquist XY 自动调整缩放至最高分辨率极限
    • 拖曳扫描区域框四角缩放，右键确认
  7. 高质量采集参数：
    • 帧大小：1024×1024
    • Pixel dwell：2.4 μs
    • Pinhole：1.0 AU
  8. 按 Capture 采集图像

四、通道配置 (Configuration)

4.1 三种操作模式

模式全称说明
DU4默认模式4 通道探测器
SDSpectral Detector光谱探测器模式
VFVariable Filter可变滤光片模式（用光谱探测器实现）

4.2 DU4 通道配置步骤

  1. 面板右上角选 Manual 设置模式
  2. 勾选最多 4 个通道
  3. 选择荧光染料和对应激光波长
    • 图表显示激光波长、荧光发射光谱、探测器发射滤光片（半透明灰框）
  4. 右下角下拉菜单选择发射滤光片
  5. 选择正确的 第一二向色镜 (1st Dichroic Mirror)——反射带需匹配激光波长
  6. 如需透射光通道，按 Transmitted Detector 的 In 按钮（通道显示为 TD）

五、多维采集 (Multi-dimensional Acquisitions)

使用 ND Acquisition 窗口进行 Z 栈、大图拼接、时间序列、多点扫描，并支持自动保存。

5.1 Z 栈 (Z Stacks)

  1. Z 设备：选 Nikon A1 Piezo Z drive 实现快速 Z 栈
  2. 按 Reset 清除之前位置
  3. 三种 Z 范围设定方式：
    • Top and bottom：标记上下限位置
    • Symmetric：以中心为对称点
    • Asymmetric：类似对称但上下层数不同
  4. Top and bottom 操作：实时扫描时对焦到样品顶部点 Top，底部点 Bottom，然后停止扫描避免淬灭
  5. 多点扫描时用 relative Z stack（Symmetric/Asymmetric 模式下）；使用 PFS 时也应用此选项
  6. 选最优步长（最佳 Z 分辨率）或自定义步数
  7. 按 Run now 开始采集；abort 中断或 finish 结束

视图切换：图像窗工具栏可切换体积视图、正交切片视图、最大强度投影。Tiled view 可逐片查看。Edit → Create view snapshot 8-bit RGB 可截图。

5.2 多点扫描 (Multi-points)

  1. ND Acquisition → XY 菜单 → add positions from live image
  2. 勾选表格中位置即可记录坐标
  3. 启用 include Z 可让每点有独立 Z 位置；PFS 启用时不需要

5.3 大图拼接 (Large Images)

快速方法：

  1. ND Acquisition → Large Image
  2. 设视场数，选 stitch + 15% overlap

高级方法（Scan Large Image）：

  1. Acquire 菜单 → Scan large image
  2. 选物镜、视场数、15% 重叠 + 混合 (blending)
  3. 可选：仅输出大图或同时保留单张图
  4. 支持 Z 栈拼接 + 每隔几个视场自动对焦（step by step focus），防止大图中失焦
  5. 点击 Scan 开始

若大图错位，需重新校准物镜。

六、数据保存 (Saving Data)

  1. Capture 按钮采集的图像需手动保存：File → Save，格式选 ND2
    • ND2 格式保存完整显微镜设置元数据，可后续复用设置
  2. 保存路径：My Documents 中自建文件夹 → 实验结束后转存至网络存储
    • 本地文档保留最多 1 周，网络盘保留最多 1 个月
  3. PPMS 系统登录后 Documents → N drive access document 有网络盘连接说明

设置复用 (Reusing Settings)

  1. 荧光强度对比实验需保持设置一致。打开图像 → 右键 → reuse camera settings + reuse device settings
  2. ND 实验设置也可复用：ND Acquisition 窗口中复用 ND setup

七、故障排除 (Troubleshooting)

优先级处理方式
第一步重启 NIS Elements 软件
第二步重启整个系统 + 计算机
第三步通知 NIC 工作人员；找不到人则发邮件或用 PPMS 事件报告系统

八、关机与整理 (Switching off & Tidying)

  1. 查 PPMS 预约系统——若 1 小时内有下一位用户，保持系统开启（除 piezo Z 驱动），仅退出软件并登出 PPMS
  2. 将数据从本地文档转移到 NICShare 网络盘
  3. 取出载物台上的样品
  4. 手动降低物镜至约 500 μm 位置，载物台回中
  5. 油镜用镜头纸+乙醇清洁
  6. 油瓶和玻片清洁剂放回图像分析室（保险柜上方架子）
  7. 垃圾分类：纸巾→普通垃圾桶、玻片→锐器盒、临床废物→TC 室黄色医疗废物桶

关键速查

项目推荐值 / 要点
针孔1.0 AU（按最长波长通道计算）
预览扫描512×512, dwell 2.2μs, 无平均
高质量采集1024×1024, dwell 2.4μs
HV 初始值100（避免 >120）
激光功率初始值3%（GaAsP 探测器通道）
像素深度12-bit（0-4095）
大图拼接重叠15%
物镜校正环40× 干式设 0.17（#1.5 盖玻片）
数据格式ND2（保存元数据，可复用设置）

关联笔记

关系图谱

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