知识库

奥林巴斯 FV3000 倒置共聚焦软件使用说明

19分钟阅读

奥林巴斯 FV3000 倒置共聚焦软件使用说明

来源：豆丁网扫描版中文PDF，FV31-SW 软件操作指南，面向操作人员的快速上手手册。 配套阅读：奥林巴斯FV3000共聚焦激光扫描显微镜产品手册（硬件参数与产品定位）、Olympus FV1000共聚焦显微镜硬件手册（上一代硬件参考）

一、软件启动

启动流程

  1. 硬件全部打开后，双击桌面上 FV31-SW 图标打开软件
  2. 进入软件过程中会有硬件识别提示弹窗：
    • XY stage 弹窗：勾选 Enable XY stage control（启用XY载物台控制），设备型号 OLYMPUS IX3-SSU，可选 Start mechanical origin search immediately（立即开始机械原点搜索）→ 点击 OK
    • 清洁提示弹窗：Do you want to execute the cleaning for 30-300?（是否执行30-300清洁操作）→ 点击 No
  3. 进入软件主界面

软件主界面布局

  • 左侧：功能参数设置栏（底部带三色通道标识）
  • 中间：大尺寸图像显示区域
  • 右侧：多组功能面板（成像参数、光路控制等设置模块）
  • 顶部标签栏：Layout / Ocular / LSM Imaging / PMT Setting / Microscope

二、目镜下找样品

⚠️ 激光安全注意事项：更换样品或需要在目镜下观察之前，一定要把光路切换到 Ocular 模式，不可在 LSM 模式下直接目镜下找样品！切换可以在软件 Ocular 页面完成，也可在触屏控制器右上角光路切换选项下完成。

根据样品情况选择相应的宽场观察方式：

方式一：透射光观察（DIC）

前置：点击 TPC 界面上方按键，切换物镜。

步骤操作
1点击 TPC 界面右上角的光路切换按键（或在 [Ocular] 工具窗口中选择 “Ocular”）
2点击 DIA 按键
3点击 [DIA] 分页
4点击 [Elements] 分页，点击插入 [Polarizer]（起偏器）
5将 DIC 滑块移入光路，或点击 [DICTA]（选配）
※ 转动 DIC 滑块旋钮，可调节图像对比度
6点击 TPC 界面左下角的 [Shutter]，打开透射光照明器的光闸
7如需调节，点击 [Brightness] 分页，调节光源亮度
8调节 Z 轴位置，找到标本焦面

方式二：荧光观察

前置：点击 TPC 界面上方按键，切换物镜。

步骤操作
1点击 TPC 界面右上角的光路切换按键（或在 [Ocular] 工具窗口中选择 “Ocular”）
2点击 EPI 按键
3点击 [EPI（或 EPI1）] 分页
4根据标本染料，选择适合的荧光滤色片
5点击 TPC 界面左下角的 [Shutter]，打开汞灯的光闸
6如需调节，选择 ND 减光片，调节光源亮度
※ 也可通过旋转汞灯控制器上的转盘调节
7调节 Z 轴位置，找到标本焦面

三、单张图像（XY）采集

3.1 PMT 设置

  1. 在 [PMT Setting] 工具窗口中，在 [Mode] 栏选择 “VBF” 模式

3.2 指定检测通道

  1. 在 [PMT Setting] 工具窗口中，点击 「Dye & Detector Select」 按钮，打开对话框
  2. 点击 「All Clear」 按钮，重置已选染料
  3. 双击列表中的染料名称，可自动添加
  4. 指定荧光染料之后，透射光(TD)通道将自动指定。如不需要 TD 通道，可双击取消

💡 虚拟通道（选配）：如标记物数量大于检测器数量，可使用此功能进行多色成像。

  1. 如需使用虚拟通道功能，点击 「Add Phase」 按钮增加 [Phase]，然后在新增 [Phase] 中添加需要观察的染料
  2. 染料选择完毕，点击 [OK] 按钮

3.3 调节预览图像

  1. 如需采集多通道图像，在 [PMT Setting] 工具窗口的 [Sequential scan] 选项中选择 “Line” 模式
    • 多标图像采集时，染料之间如有串色，建议使用此功能

3.4 扫描设置

  • 预览通常选用 live x2 或者 live x4
  • 扫描器（Scanner）类型：Galvano（振镜扫描）
  • 扫描模式（Mode）：建议先用 OneWay（单向扫描），Roundtrip 为往返扫描
  • Interlace（隔行扫描）：建议勾选

3.5 透射光通道 (TD) 观察步骤

  1. 将显微镜上的 DIC 滑块移入光路
  2. 选用 TD 通道（参见上节第5步）
  3. 选择用于成像的激光
  4. 调节透射光检测器的 HV 值
  5. 转动 DIC 滑块的旋钮，调节图像对比度

3.6 开始采集

  1. 在 [Acquire] 工具窗口中选择 [Normal] 分页，点击保存图标按键打开对话框，选择或新建保存图像的文件夹，并输入图像的文件名
    • 图像采集后将自动保存，如未更改文件名，新生成图像将自动加数字后缀（***_0001、***_0002 等）
  2. 点击 Live Scan 按键开始图像采集

⚠️ 注意：如需采集单幅图像，开始采集前务必确认 [Series] 窗口下的 [Z] 和 [Time] 均处于 “OFF” 状态。

四、序列图像采集

前置条件：开始下列步骤之前，请正确设置单幅图像采集参数（参见第三章）。

4.1 XYZ 图像采集（Z轴层扫）

设置 Z 序列

  1. 在 [Series] 工具窗口中，将 [Z] 选为 “ON”
  2. 在 [Z section] 窗口的 [Motor] 栏，选择 “Start/End”
    • 点击 Register 按键，将当前位置注册为原点 (0.00)
    • 如注册失败，可手动将 “Start” 数值改为 0，“End” 值改为 10，再重新注册

💡 Z 轴移动按键说明：

  • 向上箭头按键：移动行程 = [Step Size] 栏数值
  • 向下箭头按键：移动行程 = [Step Size] 栏数值的一半

注册起始/终止位置

  1. 转动调焦旋钮或点击 Z 轴上下移动按键改变 Z 轴位置；点击 [Start] 下方的 Register 按键，注册起始位置
  2. 继续改变 Z 轴位置，点击 [End] 下方的 Register 按键，注册终止位置
  3. 在 [Step Size] 栏输入数值（单位 μm），确定 Z 轴步进大小，层数 [Slices] 将自动调整
    • 点击 Optimal 按键：根据当前硬件可达到的最佳 Z 轴分辨率，自动输入适合的步进数值

开始/结束采集

  1. 在 [Acquire] 工具窗口中选择 [Normal] 分页，设置保存路径和文件名
  2. 点击 Start Scan 按键开始 XYZ 图像采集，采集进度和剩余时间在窗口下方显示
  3. 采集结束时，SERIES DONE 按键开始闪动 → 点击该按键结束采集
    • 如需以相同参数继续采集，输入继续采集的数量，点击 APPEND NEXT 按键

4.2 XYT 图像采集（时间序列）

设置时间序列

  1. 在 [Series] 工具窗口中，将 [Time] 选为 “ON”
  2. 在 [Time Lapse] 窗口下，设定间隔时间 [Interval] 和次数 [Cycle]

⚠️ 注意：如输入间隔时间小于采集单幅图像所需的时间，则 [Interval] 栏将显示为 “FreeRun”。此情况下实际间隔时间为 [LSM Imaging] 工具窗口中 [Scan Settings] 下方显示的 “Frame” 时间。

开始采集

  1. 在 [Acquire] 工具窗口中选择 [Normal] 分页，设置保存路径和文件名
  2. 点击 「LSM Start」 按键开始 XYT 图像采集

4.3 多点时间序列图像采集（MATL）

  1. 点击 [Live] 窗口下的 ▶ 按键
  2. 选择 [Map] 分页

注册 MATL 位点

  1. 将标本移至预期视野，调节成像参数。如需获取 XYZ 图像，则设定相应的 Z 序列（参见 4.1 节）
  2. 点击 ■ 按键，注册当前视野的位置信息和成像参数

    ⚠️ 注册后，全部图像采集相关参数（物镜参数、XY位置、焦面位置、激光强度、HV值、序列图像采集信息等）都将记录，因此应先确认图像参数之后再进行注册。

  3. 如需注册多个位点，重复第 3 和 4 步
  4. 在下方 [Repeat Setting] 窗口中，设置循环的间隔时间 [Interval] 和次数 [Cycle]

    ⚠️ 注意：“Cycle interval” 不可大于 1 小时

开始采集

  1. 在 [Acquire] 工具窗口中选择 [MATL] 分页
  2. 点击保存按键设置保存路径和文件名
  3. 点击开始按键开始 MATL 图像采集

4.4 预览图 + 大图拼接 / 多位点成像

生成预览图

前置：正确设置单幅图像采集参数。

  1. 点击 [Live] 窗口下的 ▶ 按钮
  2. 选择 [Map] 分页
  3. 使用低倍物镜，调节成像参数
  4. 点击注册按键，注册当前视野的位置信息和成像参数
  5. 在 [Registered Area List] 窗口中，拖动滑块至右侧，勾选 「OverlayMap」 对话框
  6. 在 [Acquire] 工具窗口中选择 [MATL] 分页
  7. 设置保存路径和文件名
  8. 开始 MATL 图像采集
  9. 采集结束后，预览图像将在 [Map] 分页下显示

多位点成像

  1. 使用高倍物镜，在预览图上双击鼠标左键，载物台自动移至当前视野，调节成像参数
  2. 点击「位点注册」按键，注册当前视野
  3. 重复步骤 1-2，注册多个位点
  4. 在 Registered Area List 中，勾选需要采集的位点前的 “Enable” 复选框
    • 如需将采集的图像在预览图上显示，勾选 “OverlayMap”
  5. 如需时间序列，设置 [Cycle interval] 和 [Cycle]
  6. 在 [Acquire] 中选择 [MATL] 分页 → 设置保存 → 开始采集

定义采集区域（大图拼接）

  1. 根据上述步骤获取预览图像
  2. 在预览图上双击鼠标左键，载物台自动移至当前视野，调节成像参数
  3. 点击区域注册按键注册区域，三种模式：
    • 任意区域注册：注册任意扫描区域，手动设置矩阵区域大小
    • 矩形区域注册：在预览区域注册矩形扫描区域
    • 多边形区域注册：在预览区域注册多边形扫描区域
  4. 在 [Acquire] 中选择 [MATL] 分页 → 开始采集

拼接处理

  1. 选中采集到的图像，选择 [Map] 分页，点击**「拼接」**按键
  2. 待生成预览图像之后，点击**「确认/生成」**按键

五、图像处理及保存

5.1 2D 浏览与处理

添加标尺和兴趣区域 (ROI)

  • 按住键盘上的 “Shift” 键，可画出水平或垂直的标尺
  • 工具栏按钮：ROI（兴趣区域）、标尺、全部删除

播放序列图像动画

  • 控制按钮：播放、帧率（设置播放速度）、设置播放范围（自定义播放区间）

图像视图缩放

  • 图像适合窗口大小：一键适配窗口
  • 图像原始大小：恢复原始像素尺寸
  • 选择缩放比例：可选择/输入缩放百分比
  • 序列图像信息：查看序列图像参数
  • 包含 Hi-Lo 显示模式等功能

LUT（色彩对照表）

  • 点击对应按键打开扩展窗口，进入 LUT 设置
  • 目标 CH：选择需要调整的目标通道
  • 选择 LUT：为通道选择不同的色彩对照表（伪彩方案）

灰度值直方图和 LUT 调节

  • 通过拖动滑块 ▲ 或直接输入数值，定义图像显示灰度值的最大值和最小值
    • 降低最大值 → 提高图像信号亮度
    • 提高最小值 → 扣除弱信号（背景）
  • 点击 Apply 按键，将设置应用到图像上

5.2 3D 浏览与处理

打开 Z 序列图像，选择 [Volume] 进行 3D 展示。

点击 Viewer 按键切换至浏览界面，在 [Tool Window] 菜单栏下选择 [Volume Setting]。

三种 3D 渲染算法

算法特点适用场景
AlphaBlend指定透明度算法进行图像重构，可通过 LUT 调节多通道图像的三维结构展示
Isosurface展示物体的表面形态表面形态观察，不适用于内部结构
MIP计算灰度值较高的像素位置，去除背景展示高亮度物体（最大强度投影）

Clipping / Cut（裁切/切割）

  • Clipping：在黄框内展示 3D 结构的切面，拖动鼠标可改变展示位置
  • Cut：仅在黄框内即时展示当前位置的 3D 重构图像
  • 勾选对话框将在 3D 图像上显示边框

Slice (XY / XZ / YZ) 截面显示

沿 XY / XZ / YZ 方向生成并展示 3D 重构图像的截面，可通过拖动鼠标改变截面位置。

5.3 3D 动画制作

（第14页仅显示开篇，后续内容被豆丁水印截断）

打开 Z 序列图像，选择 [Volume] 进行 3D 展示 → 点击 Viewer 切换至浏览界面 → 在 [Tool Window] 菜单栏下选择 [Volume Settings] → ……（后续步骤缺失）

5.4 图像处理 — 亮度投影

  1. 点击 Viewer 按键切换至浏览界面
  2. 在 [Tool Window] 菜单栏下选择 [Analysis]，打开工具窗口
  3. 选择 “Single process”，点击 “Post processing” 按键
    • 可选模式：Single process（单处理）/ Multiple process（多处理）
    • 可选类型：Live processing（实时处理）/ Post processing（后处理）
  4. 在下方窗口选择 [Processing] 分页，在 [Processing Item] 中点击 “Projection”
  5. 点击 [Input]，选择需处理的图像名称
  6. 在 [Processing Property] 中选择处理模式：
    • Max：最大亮度投影
    • Min：最小亮度投影
    • Ave：平均亮度投影
  7. 点击 Process 按键，处理图像
  8. 处理结束后，将生成新的文件

5.5 图像输出（导出）

将图像保存为可供第三方软件识别的格式。

输出单个图像文件

  1. 在图像上单击鼠标右键，选择弹出菜单中的 [Export]，打开导出对话窗口
  2. 框内显示图像输出位置，如需改变，点击文件夹样式按键更改保存位置
  3. 在 [Save as type] 栏中选择输出图片类型
  4. 在 [CH/Range] 窗口中，选择需要输出的通道；如为序列图像，可设置输出范围和步进
  5. 如选择了常规图像格式，可选择是否将图像上的 ROI 和标尺印入图像
  6. 如选择了常规图像格式，可选择输出图像的位数和模式（彩色/黑白）
    • 建议输出模式：RGB Color with Merge → 24bit Full Color → Amount
  7. 勾选对应选项，**图像属性（图像采集条件）**将输出为文本文档
  8. 点击 Save 按键，输出图像

关键操作速查表

操作入口核心设置
切换目镜/共聚焦模式Ocular 工具窗口 / 触屏控制器右上角Ocular vs LSM
通道设置PMT Setting → Dye & Detector SelectVBF 模式 + 染料选择 + Sequential scan
Z 序列采集Series → Z → ON → Z sectionStart/End 位置 + Step Size + Optimal
时间序列Series → Time → ON → Time LapseInterval + Cycle / FreeRun
多位点采集Live → Map → Register → MATL位点注册 + Cycle interval ≤1h
大图拼接Map → 区域注册 → 拼接 → 确认生成任意/矩形/多边形三种区域模式
3D 重建Viewer → Volume → Volume SettingAlphaBlend / Isosurface / MIP
亮度投影Viewer → Analysis → ProjectionMax / Min / Ave 三种投影模式
图像导出图像右键 → Export格式 + 通道 + 标尺/ROI + 元数据

与其他共聚焦软件的对比参考

  • 与 Zeiss ZEN 软件类似，FV3000 也采用 工具窗口 (Tool Window) 模块化布局
  • FV3000 的 MATL（多位点时间序列）对应 Zeiss 的 Multi Time Series / Tiling 功能
  • 3D 渲染三算法（AlphaBlend / Isosurface / MIP）为业界标准配置，Leica LAS X 也有对应功能

关系图谱

反向链接