共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色 —— Leica TCS SP5 II
制作单位：临床医学研究中心 设备型号：德国 Leica 激光扫描共聚焦显微镜 SP5 II
一、仪器基本参数
| 参数 | 规格 |
|---|---|
| 型号 | 德国 Leica SP5 II |
| 激光器 | 4 个，发射波长 400nm - 800nm |
| 物镜 | 10×、20×、63× |
| 通道 | 多通道、多色 |
| 操作系统 | Windows 7 + LAS AF 软件 |
| 活体细胞装置 | 配有 |
二、激光扫描共聚焦显微镜基本特点
- 观察方式：以荧光为主
- 光源：激光（紫外、可见光）
- 照明方式：点照明、逐点扫描
- 成像方式：共聚焦、逐点成像
- 输出：实时观测，数字化图像，可进行图像处理和定量分析
- 多重染色样品观察：支持多色荧光同时成像
三、基本功能
1. 高清晰度、高分辨率图像采集
| 显微镜类型 | 分辨率 |
|---|---|
| 光学显微镜（宽场 WIDE-FIELD） | 0.25 μm |
| 共焦显微镜（CONFOCAL） | 0.18 μm |
共聚焦通过针孔滤除焦外杂光，成像比宽场显微镜更锐利清晰，信噪比更高。
2. 定位、定量分析
- 多荧光标记共定位分析（如红色+绿色荧光重叠区域呈黄色）
- 荧光强度定量测量
- 亚细胞水平定位（如核、胞质、膜等）
3. 连续光学切片（Z-Stack）+ 三维重构
- 无损伤、连续光学切片，即显微”CT”
- 沿 Z 轴逐层扫描获取多层焦平面图像
- 通过软件三维重构成像，可任意角度观察样本空间结构
- 适用于厚样本（组织、类器官等）的三维结构分析
4. 活体细胞动态观察 & 快速扫描成像
- 活体细胞荧光染色的动态观察
- 时间序列（Time-lapse）快速扫描成像
- 可追踪秒级（如 20s / 40s / 60s / 80s / 100s 等）的动态变化
- 实时定量荧光强度变化（Mean Intensity vs Time 曲线）
四、LAS AF 软件界面
徕卡共聚焦操作软件，主要分区：
| 区域 | 功能 |
|---|---|
| 顶部标签栏 | Acquire（采集）等功能模块切换 |
| 左侧控制面板 | Scan Mode（扫描模式）、物镜、Zoom、光路/焦平面示意图、Z-Stack、Mosaic 拼接、Autofocus |
| 中间参数区 | Beam Path Setting（光路设置）、Start Laser 启动激光、激光功率调节（%）、多通道光谱设置、通道预设（Active / Det / Laser） |
| 右侧图像区 | 实时成像显示窗口 + 图像工具栏 |
| 底部功能区 | LIVE 实时成像、System Setup 系统设置、Time 时间序列 |
五、在生物医学中的主要应用
（一）原位鉴定细胞/组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构
- 细胞原位检测核酸
- 原位检测蛋白质、抗体及其他分子
- 检测细胞凋亡
- 细胞器观察及测定
- 观察细胞骨架
- 检测细胞融合
- 检测细胞内脂肪
（二）活体细胞或组织功能的实时动态监测
- 细胞内离子动态变化的测量（如 Ca²⁺）
- 膜电位的测量
- 细胞内 pH 值的测定
- 检测细胞内活性氧物种（ROS）的产生
- 检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位
六、日常保养及注意事项
基础操作与环境
- 按照手册正确操作，如有疑问及时联系 Leica 工程师寻求专业帮助
- 保证外部电源供应稳定
- 保持室内恒温、清洁、干燥：室温 22-25℃，相对湿度 80% 以下为宜（环境变化会影响精密器件相对位置）
- 定期校准：使用一段时间后精密器件可能因环境因素偏移，需联系 Leica 专业工程师调校
- 油镜使用后清洁：用无水乙醇清洁镜头前部
使用规范
- 短时间停顿工作时，无需关闭系统
- 仅做图片分析时，无需打开激光器控制钥匙，以减少激光器损耗
- 避免使用外界存储设备（U盘、移动硬盘等），防止电脑病毒感染
- 不要安装包含杀毒软件在内的任何未经软件生产商授权和 Leica 工程师认可的软件
七、荧光探针选择
选择荧光探针的主要步骤：
- 根据实验目的确定需要检测的目标
- 确定可供选择的荧光探针的范围
- 考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求
- 确认荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况（激发/发射波长是否匹配激光器和检测器）
八、样品要求
通用样品类型
- 样品经荧光标记
- 组织切片：载玻片 + 盖玻片封片
- 固定的或活的贴壁培养细胞：培养在共聚焦专用小培养皿或盖玻片上
- 悬浮细胞：甩片或滴片后，用盖玻片封片
玻片与标本要求
- 载玻片厚度：0.8～1.2 mm
- 盖玻片：光洁，厚度约 0.17 mm
- 标本不能太厚（太厚则激发光大部分消耗在标本下部，物镜直接观察的上部不能充分激发）
- 尽量去除非特异性荧光信号
- 封片剂多用甘油:PBS 混合液（9:1）
适用器皿
| 器皿类型 | 适用样品 | 说明 |
|---|---|---|
| Slide（玻片） | 细胞爬片、组织切片、细胞滴片/甩片 | 盖玻片上培养细胞或粘贴切片，处理后倒扣于载玻片 |
| Petri dish（培养皿，35mm / 50mm） | 活细胞成像 | 35mm 塑料平皿底部打直径 ~1cm 圆孔，底部外侧粘 0.17mm 盖玻片密封 |
九、免疫荧光染色实验方法
方法一：活细胞直接免疫荧光染色（溶酶体或钙离子）
- 将 A549 细胞培养于 35 mm 激光共聚焦培养皿中间的圆形凹槽里
- 染色前吸除培养液，PBS 洗 2-3 次
- 轻轻滴入 Lyso-Tracker Red 或 Fluo-4/AM 工作液 200μL，覆盖全部细胞
- 37℃、5% CO₂ 培养箱中孵育 30 min
- 吸除染液，PBS 洗 2-3 次
- 加入 800μL PBS 覆盖细胞，激光共聚焦显微镜观察 Ca²⁺ 变化
方法二：间接免疫荧光染色（FITC 标记）
（1）收集细胞
收集细胞爬片 → 吸取各培养孔上清 → PBS 冲洗（5min × 3）→ 4% 多聚甲醛固定 20min → 晾干备用
（2）通透及封闭
PBS 冲洗（5min × 3）→ 0.3% Triton X-100 穿透细胞膜 5min → PBS（5min × 3）→ 2% BSA 封闭抗原 30min
（3）滴加一抗
滴加 PBS 稀释的一抗 → 湿盒内 4℃ 孵育过夜
- 空白对照：PBS 代替一抗
- 同型对照：兔/鼠血清或 IgG 亚型代替一抗
（4）滴加二抗
PBS 冲洗（5min × 3）→ 滴加 FITC 标记的羊抗兔/鼠二抗 → 37℃ 孵育 60 min（避光）
（5）染核并封片
PBS 冲洗（5min × 3）→ DAPI 染核 5min → PBS 冲洗（5min × 3）→ 滴加抗荧光淬灭封片液
（6）激光共聚焦显微镜拍照
十、Leica 网上学习资源
- Leica Science Lab 网址：www.leica-microsystems.com/science-lab
- 定位：科学与教育门户网站，涵盖显微技术与组织学从基础到应用的全方位内容
- 核心主题（9 大方向）：
- Histology Sample Preparation（组织学样品制备）
- IHC & ISH Advanced Staining（免疫组化与原位杂交高级染色）
- Routine & Special Staining（常规与特殊染色）
- CARS Microscopy（相干反斯托克斯拉曼散射显微镜）
- Super-Resolution（超分辨率显微）
- Laser Microdissection（激光显微切割）
- Confocal Microscopy（共聚焦显微镜）
- Basics in Microscopy（显微技术基础）
- Neuroscience（神经科学）
- 标语：Learn. Share. Contribute.