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Leica TCS SP5 共聚焦激光扫描显微镜用户指南

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Leica TCS SP5 共聚焦激光扫描显微镜用户指南

编辑：Donald Pottle，Schepens 眼科研究所 设备：Leica TCS SP5 正置 DM6000S 共聚焦显微镜（Spectral Photometric 5 型） 软件：Leica Application Suite (LAS AF) v2.0.2 本笔记覆盖 PDF 中第 19-48 页内容，为整套三部分用户指南的第一部分：基础图像采集的核心操作章节。

一、文档概述

这份用户指南是 Schepens 眼科研究所细胞生物学共聚焦显微镜室的官方操作教材，由 Donald Pottle 编辑。整套指南分为三部分，本 PDF 收录的是第一部分”基础图像采集”的中段（第 19-48 页），以图文对照的分步操作形式讲解从开机软件启动到图像保存的完整基础流程。

特点：

  • 每步操作都有界面截图+红圈标注+步骤编号，适合新手按图操作
  • 大量操作小贴士（NOTE）穿插其中
  • 使用铃兰（Convallaria）、小鼠肾小球（Mouse Kidney Glomerulus）等标准样品做演示
  • 内容偏向实际操作而非理论讲解

二、完整操作流程（按步骤梳理）

第 1 步：启动 LAS AF 软件

  1. 双击桌面上的 Confocal LAS AF 图标
  2. 弹出 Leica Application Suite 启动窗口 → 点击 OK
  3. 弹出 Microscope Stand 初始化弹窗 → 若载物台已初始化则点击 No
  4. 整个软硬件初始化过程约需 2 分钟

第 2-3 步：主界面总览

LAS AF 软件顶部有 4 个功能标签页：

标签功能
Configuration系统配置（硬件/激光/物镜/光路/载物台等）
Acquire图像采集（主要工作模块）
Process图像处理
Quantity定量分析

Acquire 标签页下又分两个子标签：

  • Experiments：实验文件列表（虚拟内存窗口）
  • Acquisition：采集参数设置

第 3-6 步：配置荧光检测系统

进入 Configuration → Hardware Configuration → Laser 打开激光开关窗口：

  1. 勾选实验所需的激光线
    • 405nm 二极管激光（紫外，用于 DAPI 等紫外激发染料）
    • Argon 氩离子激光（458/476/488/514nm）
    • HeNe 543（氦氖绿激光）
    • HeNe 633（氦氖红激光）
  2. 若使用氩离子激光，将功率滑块调至约 25%

NOTE：DAPI 的发射光谱与其他荧光重叠度很高，使用 DAPI 时必须采用**序列扫描（Sequential Scanning）**消除通道串色。

硬件配置区其他可配置项：

  • Microscope（显微镜）、Objective（物镜）、Beam Path（光路）
  • Stage（载物台）、Dyes（染料）、Ctrl Panel（控制面板）
  • Super-Z、IPS Masks

第 7 步：进入采集模式

点击 Acquire 标签页，默认采集参数：

  • 扫描模式：XYZ（三维扫描）
  • 图像格式：512 × 512
  • 扫描速度：400 Hz
  • 像素尺寸：758nm × 758nm
  • 视野尺寸：387.50μm × 387.50μm

第 8-10 步：设置光路（Beam Path）

  1. 选择光区：Visible（可见光） 和/或 UV（紫外光）
  2. 在 Leica Settings 下拉菜单中选择预设荧光团配置方案
    • 例如：FITC-TRITC-Cy5 三色组合

常用荧光染料参考：

荧光染料激发激光发射颜色
Alexa 488 / FITC / GFP488nm 氩离子蓝激光绿色
Alexa 568 / TRITC568nm 或 543nm 绿激光红色
DAPI405nm 半导体激光蓝色（光谱重叠多）

第 11-12 步：PMT 检测通道设置

每个 PMT 通道的设置项：

  1. 荧光基团选择：下拉菜单选择目标荧光团（如 Leica/ALEXA 488）
  2. 通道激活：勾选 Active 复选框启动通道
  3. 检测滑块调节：
    • 光谱条下方的滑动条控制检测波长范围
    • 将滑块对准荧光发射峰位置，减少串色
    • 可拖拽滑块两端做精细波长范围调节

PMT 通道数量：标配 PMT1-PMT4 四个光电倍增管检测通道，另有透射光检测器（PMT Trans）。

第 13 步：Live 实时预览与扫描

底部操作控制区按钮：

  • Best Focus：最佳对焦
  • Live：实时预览扫描
  • Capture image：捕获单张图像
  • Start：启动序列采集（XYZ 等）

第 14 步：变焦功能（Zoom Function）

  • 原理：光学变焦，通过缩小扫描区域实现放大，不是数码放大
  • 操作：显微镜控制面板上的 Zoom 旋钮调节变焦倍数
  • 图像居中：XY 视图窗口点击方向箭头，可将目标区域居中
  • 示例：400 倍物镜 + 4.26 倍变焦

第 15 步：扫描视野旋转（Scan Field Rotation）

  • 作用：将图像”调正”，因为 TCS-SP5 载物台无法手动旋转
  • 操作：控制面板上的 Scan Field Rotation 旋钮
  • 效果：可将倾斜的成像结构旋转至端正方向

第 15-16 步：Smart Gain & Smart Offset

控件功能操作方法
Smart Gain 旋钮调节图像亮度（增益）点击图像模板中目标通道（出现白框），旋转增益旋钮
Smart Offset 旋钮调节图像对比度（偏移）同样配合通道选择调节

特点：Smart Gain 自动匹配选中的通道；调节增益不会造成样本光漂白。 目标：生成明亮清晰、背景噪声少的图像。

第 17-19 步：QLUT 伪彩调参法

要获得最高质量图像，增益和偏移需要互相适配。最简便的方法是先用伪彩显示再调参：

  1. 点击 QLUT 按钮（Quick Look-Up Table，快速查找表） → 图像转换为伪彩色强度显示
  2. 调节增益：让图像大部分呈现黑-橙-白色，蓝色像素极少
    • 蓝色 = 信号饱和（强度 255）
    • 黑-橙-白 = 有效信号范围（1-254）
  3. 调节偏移：让背景区域主要呈现绿色
    • 绿色 = 无信号（强度 0 = 背景）
  4. 双击 QLUT 按钮：切换回真实颜色显示

三、图像工具（Image Tools）

工具栏功能一览

左侧竖排工具：

  • 展开工具选项
  • 移动屏幕上选中的项目
  • 删除（回收站）
  • 插入比例尺/测量条（点击拖拽）
  • 图像缩放
  • 调整图像保存尺寸（避免像素化）

上方标注工具（Annotation Tools）：

  • 线条、椭圆、矩形、箭头、文字标注等

右侧通道与投影工具：

  • 序列扫描通道开关选择
  • 所有通道叠加
  • 最大强度投影（Maximum Intensity Projection）：对 Z 序列所有图像做最大投影
  • 正交投影（Orthogonal Views）：显示 Z 栈序列的 X/Y 垂直切面
  • 序列扫描时的图像查看功能

底部：影片播放控制控件 + 切片滑块（浏览 Z 栈/序列图像）

正交视图（Orthogonal Views）

  • 功能：对 Z 轴层叠图像生成 XZ 和 YZ 方向的垂直切面视图
  • 三个视图（XY / XZ / YZ）通过黄色十字准线联动
  • 入口：右侧工具栏的正交视图图标
  • 技巧：右键 → Hide Crosshair 可隐藏十字准线

四、图像保存

保存要点

  1. 数据的临时性：Acquire 和 Experiments 标签页中的图像数据仅存储在虚拟内存中，关机即丢失
  2. 保存操作：右键点击实验文件夹/图像/序列名称 → 弹出菜单：
    • Close experiment（关闭实验）
    • Save experiment / Save all（保存实验/全部保存）
    • Create Collection（创建合集）
    • Delete / Rename / Copy experiment
    • Export（导出）：支持 Tiff、JPEG、AVI 三种格式
  3. 保存路径：保存到 D 盘数据文件夹或其他存储介质
  4. 重要提醒：工作过程中要频繁保存，防止数据丢失

五、离线工作站（Off-Line Work Station）

设置目的

在共聚焦显微镜工作站上处理 3D 旋转、影像类数据会占用大量显微镜时间，因此需要将数据转移到离线工作站处理，把设备让给其他用户。

两款 LAS 软件版本

版本位置功能备注
LAS AF 完整版西 249 室完整处理功能需要硬件加密狗
LAS AF Lite 家用版个人电脑无 3D 旋转，单显示器可申请安装程序

离线工作站配置

  • 双显示器台式工作站
  • 左屏：3D 旋转影像（3D ROTATION MOVIE .avi）
  • 右屏：Z 层叠序列影像（Z-STACK MOVIE .avi）
  • 配 APC 不间断电源

六、与其他 Leica SP5 手册的对比

手册名称来源语言特点
本指南（Donald Pottle）Schepens 眼科研究所英文图文分步操作，最适合新手入门，第19-48页覆盖基础采集全流程
Leica-TCS-SP5激光共聚焦显微镜系统软件操作手册徕卡官方（中文版）中文文字版 PDF，侧重软件默认设置和4种基本扫描模式
Leica-TCS-SP5共聚焦显微镜中文操作手册-by-jennifer用户整理（jennifer）中文10大模块快速操作指南，偏实用速查
共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色-Leica-SP5-II临床医学研究中心中文PPT 风格课件，设备介绍+生物医学应用+样品制备

七、关键操作速查表

操作入口/控件
启动软件桌面 Confocal LAS AF 图标
开激光Configuration → Hardware Config → Laser
选荧光方案Beam Path → Leica Settings 下拉
调检测通道PMT 通道下拉 + Active 勾选 + 检测滑块
实时预览Live 按钮
光学变焦Zoom 旋钮
图像旋转Scan Field Rotation 旋钮
调亮度Smart Gain 旋钮（先点选通道）
调对比度Smart Offset 旋钮
伪彩调参QLUT 按钮单击开启/双击关闭
最大强度投影右侧工具栏 MIP 图标
正交视图右侧工具栏 Orthogonal Views 图标
保存图像右键实验名 → Save / Export

关系图谱