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荧光补偿算法-液相芯片多色荧光检测

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荧光补偿算法——液相芯片多色荧光检测

来自液相芯片项目的荧光补偿算法文档，阐述软件全矩阵补偿（Full Matrix Compensation）的数学原理和计算方法。 相关：流式细胞仪详细设计说明书-CLFCS-V1.0、半自动双激光流式细胞仪串口通信协议-液路上样单元命令全集

一、核心原理

多色荧光检测中，由于荧光发射光谱重叠，一个荧光通道的信号会”泄漏”到其他通道（串色/串扰）。荧光补偿的目的就是从实测的混合信号中，还原出每种荧光的真实强度。

二、软件全矩阵补偿步骤

  1. 在每个 PMT 上对于每一个荧光计算**“叠加荧光素”的比率**（即串扰系数/泄漏比）
  2. 通过矩阵运算去除或加上交叉干扰

三、数学模型

3.1 实测信号公式

PMT = K × FL + A
符号含义说明
PMT实测荧光信号向量每个通道探测器实际读到的信号值（含串扰）
FL真实荧光信号向量每种荧光染料的真实发射强度（待求）
K荧光泄露矩阵K_ij 表示荧光 FL_i 泄漏到探测器 PMT_j 的比例
A噪声/背景信号向量暗电流、环境背景光等固有偏移

3.2 荧光泄漏的物理过程

  • 每个荧光源 FL_i 的信号，大部分进入自己对应的探测器 PMT_i
  • 小部分信号会泄漏到其他通道（K_ij 即泄漏比例）
  • 所有通道的分配比例之和为 1

3.3 补偿（解串扰）公式

从实测信号反推真实荧光，即求逆运算：

FL = K⁻¹ × (PMT - A)

其中 K⁻¹ 是荧光泄漏矩阵 K 的逆矩阵，也称为补偿矩阵。

运算步骤：

  1. 实测信号 PMT 减去背景噪声 A，得到纯荧光贡献的观测值
  2. 乘以串扰矩阵的逆矩阵 K⁻¹，解混得到各通道真实荧光强度 FL

四、两色荧光补偿示例（FITC / PE）

以 FITC（FL1）和 PE（FL2）两色荧光为例：

4.1 实测信号

PMT1 = FITC + x% × PE    （PE 有 x% 泄漏到 PMT1）
PMT2 = PE   + y% × FITC  （FITC 有 y% 泄漏到 PMT2）

4.2 补偿矩阵（K 的逆矩阵）

          1          [  1    -x% ]
补偿矩阵 = ———— ×
        1 - x%y%     [ -y%    1  ]

4.3 补偿后的真实荧光

        x% × PMT2 - PMT1
FITC = ————————————————
         x% × y% - 1

        y% × PMT1 - PMT2
PE   = ————————————————
         x% × y% - 1

五、关键概念定义

名词定义
PMT实测荧光信号（探测器读数）
FL待求的真实荧光矩阵
A噪声/背景信号
K荧光泄露矩阵，k_ij 是荧光信号 FL_i 泄露到荧光检测 PMT_j 的荧光泄露比
K⁻¹补偿矩阵（泄漏矩阵的逆矩阵）

六、工程实现要点

  1. 串扰系数标定：需要用单荧光素对照样品（compensation beads/单染管）预先测定每个荧光对各通道的泄漏比例，构建 K 矩阵
  2. 背景扣除：补偿前必须先扣除探测器暗电流和环境背景 A
  3. 矩阵求逆：N 色荧光需要 N×N 矩阵求逆，两色用 2×2 解析解，多色需要数值求逆
  4. 扩展到多色：两色补偿可直接推广到 N 色（N 个荧光通道对应 N×N 的串扰矩阵），只需保证矩阵可逆（即各荧光光谱不完全线性相关）

关联

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