激光扫描共聚焦显微镜使用技巧和注意事项
奥林巴斯（中国）有限公司 培训PPT，共 61 页，前 18 页为全球用户显微成像案例展示，第 19 页起为正文操作技巧与注意事项。
一、标本准备
1.1 常用培养器具
共聚焦观察推荐使用的培养容器（底部厚度需匹配物镜的盖玻片校正要求）：
- 薄底培养皿（0.17mm 底厚）—— 共聚焦观察推荐
- 有盖玻片（0.17mm）的玻片标本 —— 共聚焦观察推荐
- 其他：培养瓶（50/250/550ml）、培养皿（35/60/100mm）、培养板（6/12/24/48/96 孔）
1.2 标本放置
- 核心原则：细胞贴壁的一面朝向物镜、靠近物镜一侧
- 盖片标本放置方向：
- 盖片向下 → 倒置显微镜
- 盖片向上 → 正置显微镜
- 玻片固定：玻片四角用透明指甲油固定，避免油镜观察时引起标本移动
1.3 共聚焦成像对标本的基本要求
- 肉眼能看到荧光信号 —— 共聚焦针孔会阻挡大量焦外信号，实际检测到的焦平面荧光远少于宽场，标本本身荧光必须足够强
- 必须先用宽场荧光观察确认标本 —— 确认有信号再上共聚焦，避免浪费时间和损伤标本
原理：共聚焦利用针孔阻挡非焦平面荧光信号，意味着其实际检测的焦平面荧光信号比传统宽场荧光显微镜更少。
二、物镜的正确使用
2.1 物镜是显微镜的核心
- 光学分辨率由物镜决定（不是显微镜机身）
- 分辨率公式：D = 0.5 × λ / NA
- D：光学分辨率（可分辨的最小细节尺寸）
- λ：成像所用光的波长
- NA：物镜数值孔径
- 荧光亮度公式：亮度 ∝ NA⁴ / M²
- 亮度与 NA 的 4 次方成正比，与放大倍数 M 的平方成反比
- 说明 NA 对荧光亮度的影响远大于放大倍率
2.2 高 NA 物镜是获取亚细胞/大分子图像的必须
奥林巴斯高 NA 物镜代表型号：
| 型号 | NA | 类型 |
|---|---|---|
| UPLFLN40XO | 1.30 | 油浸 |
| UAPO40XO | 1.30 | 油浸 |
| PLAPON60XO | 1.42 | 油浸 |
| UPLSAPO60XW | 1.20 | 水浸 |
| UPLSAPO100XO | 1.40 | 油浸 |
2.3 操作规范
- 从低倍到高倍依次找标本、观察、扫描成像
- 4X（NA 0.16）→ 10X（NA 0.4）→ 20X（NA 0.6）→ 40X（NA 0.9）
- 油镜使用禁忌：一旦采用油镜观察，不能再直接切换到低倍，因为会污染低倍物镜
2.4 校正环的使用（校正球差）
适用场景：
- 盖玻片或培养皿底部厚度不标准时
- 需要看细胞或组织深层时
调节方法：先调焦，再调校正环（不能反过来）
三、核心参数设置技巧
3.1 预览模式 —— 快速找到标本
- 推荐值：Focus ×2 或 Focus ×4（快速聚焦预览模式）
- 降低扫描分辨率到 512×512
- 作用：快速调整焦平面，迅速找到标本
- 优势：尽量避免激光毒性对标本的漂白（预览快，激光照射时间短）
3.2 亮度补偿 —— AutoHV
- AutoHV：自动补偿电压值
- 推荐：一直保持按下状态（自动模式）
3.3 针孔（Pinhole）
原理：针孔阻挡非焦平面荧光，仅让焦平面信号通过到 PMT，是共聚焦的核心部件。
默认状态：一般情况 Pinhole 处于 Auto（自动）状态。
针孔大小使用策略：
| 标本类型 | 针孔策略 | 目的 |
|---|---|---|
| 薄标本（活细胞等） | 增大针孔 | 提高图像亮度，更好反差，保护标本 |
| 厚标本（厚组织切片等） | 减小针孔 | 获取更薄的光切层，更好细节 |
找标本技巧：转共聚焦模式后，如不好寻找标本，将针孔模式转为手动，针孔调至 300μm 以上，找到标本后再使用 AUTO 模式。
针孔大小与成像性能关系：
| 参数 | 针孔增大 | 针孔减小 |
|---|---|---|
| 图像分辨力 | 低 | 高 |
| Z 轴光切厚度 | 厚 | 薄 |
| 图像反差（对比度） | 高 | 低 |
| 图像亮度 | 高 | 低 |
3.4 激光强度
- 原则：用尽量低的激光成像，避免光毒性和光漂白
- 注意：但不可教条，具体情况具体分析
- 光毒性 vs 光漂白是两个不同概念
3.5 扫描速度
- 核心结论：扫描速度与图像质量成反比
- 选择原则：
- 要高质量图像 → 适当放慢扫描速度
- 要快速成像 → 适当牺牲图像质量
- 推荐值：8~10 μs/pixel（常规成像）
- 建议：适当放慢扫描速度，可获得更佳的成像信噪比
参数含义：
- P：Pixel，单像素扫描时间（μs）
- L：Line，单行扫描时间（ms）
- F：Frame，单帧扫描时间（s）
- S：Sequence，序列总时间（s）
3.6 快速测量的实现方式
适用于活细胞钙成像等需要高时间分辨率的实验：
- 改变扫描速度（加快）
- 采用双向扫描
- 减少采样点数（牺牲空间分辨率）
- 采用线扫描（X-T 模式）
典型应用：KCl 诱导的细胞外 Ca²⁺ 内流测量 —— 通过快速时间序列成像捕捉加药后细胞钙浓度快速升高的动态过程。
3.7 扫描分辨率
⚠️ 扫描分辨率不是光学分辨率！
- 光学分辨率未能区分出的细节，扫描分辨率再高也是重复扫描，没有实际意义
- 举例：以 NA 1.4 的 60X 油镜为例，最佳扫描分辨率为 2048×2048 即可
常用扫描分辨率选择：
- 64×64、128×128 —— 极快预览
- 512×512、640×640、800×800、1024×1024 —— 推荐值（红框范围）
- 2048×2048 —— 高分辨率成像
- 4096×4096 —— 极高分辨率（谨慎使用，扫描极慢）
3.8 图像放大（ZOOM）
- 优先原则：优先考虑使用高倍物镜（光学放大），而非数字 ZOOM
- 推荐值：ZOOM 不高于 4~6 倍（过高数字放大导致画质劣化）
- 示例对比：ZOOM 1X → 4X → 10X，10X 时出现明显的画质损失
3.9 降低图像噪音
- 推荐：Kalman 滤波打开
- 模式：Line（行平均）；静态标本可使用 Frame（帧平均）
- 数值推荐：2 或 3 次
Kalman 滤波是一种递归滤波方式，在逐行/逐帧扫描时实时平均降噪，比简单平均更高效。
3.10 多色荧光成像 —— 避免串扰
多标实验选择序列扫描 + 染料最适带宽，避免窜扰和自发荧光
- 序列扫描（Sequential）：不同通道分时采集，减少发射光谱重叠带来的窜扰
- 选择合适的检测带宽：在光谱设置面板中为每个通道设置最优的起止波长
- 例：CHS1（Alexa Fluor 488）：500~530nm（带宽 30nm）
- 例：CHS2（Mito Tracker）：555~625nm（带宽 70nm）
- 通道示例：Alexa Fluor 488（488nm 激光）+ Mito Tracker（543nm 激光）+ Cy5（633nm 激光）
四、图像调节（显示后处理）
⚠️ 图像调节仅用于显示反差需要；如做荧光强度定量比较实验，不建议使用（会改变显示数值，影响定量准确性）。
4.1 LUT（查找表）调节
调节内容：图像灰度值范围、背景、显示颜色
LUT 面板核心参数：
- Min / Max：显示的最小/最大强度阈值（原始强度范围 0~4095，12 位）
- Gamma：中间调亮度调节（默认 1.00）
- Intensity / Contrast：亮度 / 对比度
- 伪彩选择：Green、FITC、Red、Blue、Cyan、Magenta、Yellow、Orange、Fall、Gray、Hi-Lo 等多种预设
4.2 增强显示
- 降低 Max 阈值（如从 4095 降到 1544），让弱信号更清晰可见
- 本质是压缩显示的动态范围，提升视觉对比度
4.3 扣除背景
- 提高 Min 阈值（如从 0 升到 167），将低强度背景信号设为黑色
- 用于去除背景噪音，让目标信号更突出
五、荧光染料选择
5.1 理想的荧光染料或探针
- 高 QE（量子产率/量子效率） —— 荧光亮度高，检测灵敏度好
- 不容易漂白（抗光漂白） —— 支持长时间成像、多次观察
- 对活细胞无或少光毒性 —— 活细胞成像核心要求
- 与自发荧光重叠少 —— 降低背景干扰，提升信噪比
- 多标尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠 —— 减少串色
- 多标选择发射波段距离远的不同探针 —— 进一步避免光谱串扰
5.2 常用细胞器荧光探针（Molecular Probes）
| 靶标结构 | 代表探针 |
|---|---|
| 细胞核 | DAPI、Hoechst 33342、SYTOX Green/Orange、TO-PRO-3 |
| 线粒体 | MitoTracker Red/Green/Orange、DiOC₆(3) |
| 内质网 | ER-Tracker Blue-White DPX |
| 高尔基体 | BODIPY FL/TR C₅-ceramide |
| 细胞质膜 | DiI、DiO、DiD、WGA Alexa Fluor 488 |
| 细胞骨架（微管） | Tubulin Tracker Green、anti-beta tubulin |
| 细胞骨架（肌动蛋白） | Alexa Fluor 488 phalloidin、rhodamine phalloidin |
| 溶酶体 | LysoTracker Red/Green、LysoSensor Yellow/Blue |
| 胞质 | Calcein AM、CellTracker Green/Red |
| 胞质 Ca²⁺ | fura-2 AM、fluo-3 AM、fluo-4 AM |
| 胞质 pH | BCECF AM、carboxy SNARF-1 |
5.3 光谱拆分（Spectral Unmixing）
别名：光谱反卷积（spectral deconvolution）
适用场景：
- 各种荧光染料普遍存在发射光谱重叠 → 染料串色（DAPI/FITC 等）
- 背景自发荧光干扰（组织 FISH、植物标本等）
原理：利用不同荧光物质独特的发射光谱（“光谱指纹”），将混合的荧光信号拆解为每种探针的独立信号。
效果：例如 YOYO-1（细胞核）和 Alexa 488（F-actin）发射光谱重叠，单通道无法区分；光谱拆分后可将两者完全分离为不同颜色通道。
六、操作注意事项
6.1 油镜使用注意
过多镜油的危害：
- 污染其他镜头
- 污染显微镜机身
- 浪费
推荐操作：
- 一小滴镜油即可
- 用完立即清洁
6.2 关机注意事项
- 待灯箱冷却后，再盖上防尘罩
6.3 维护与保养
| 项目 | 说明 |
|---|---|
| 清洁液 | 无水乙醇（分析纯） |
| 清洁工具 | 擦镜纸、镊子、吹气球 |
| 清洁方向 | 由内自外，顺时针或逆时针（螺旋式擦拭） |
6.4 清洁位置
需要定期清洁的光学部件：
- 目镜
- 聚光镜顶部
- 物镜
6.5 激光安全
- 激光等级：Class 3B —— 直接观察光束是危险的
- 警示：打开时有 3B 类激光辐射，避免光束直射眼睛
激光危险等级速查：
| 等级 | 危险程度 |
|---|---|
| Class 1 | 无论何种光学系统观察都安全 |
| Class 1M | 裸眼安全，通过光学设备观察危险 |
| Class 2 | 可见光 400-700nm，靠瞬目反射保障安全 |
| Class 2M | 裸眼等同 Class 2，光学设备观察危险 |
| Class 3R | 直接观察光束有潜在危险 |
| Class 3B | 直接观察光束危险（共聚焦激光级别） |
| Class 4 | 漫反射都危险，可引发火灾、损伤皮肤 |
七、实用功能
7.1 采集参数一键调取
OIB/OIF 文件（奥林巴斯图像格式）记录所有采集参数，可一键从已有图像文件调回到采集面板。
可调取的参数：扫描速度、扫描分辨率、激光强度、检测器 HV、针孔大小等全部采集参数。
操作：在打开的 OIB 图像查看窗口中点击 << 按钮，即可将该文件的所有采集参数应用到 2D 控制面板。
八、推荐学习资源
- 佛罗里达州立大学 Molecular Expressions 光学显微镜入门教程
- 网址：
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/ - 内容：光学显微镜、数字成像、显微摄影的系统入门教程
- 包含：基础概念、数字成像、虚拟显微镜、共聚焦显微镜、活细胞成像、荧光等专题
- 资深显微镜专家 Mortimer Abramowitz 解答 50 个常见问题
- 网址：
文档结构概览
| 页码 | 内容 |
|---|---|
| 1 | 封面：激光扫描共聚焦显微镜使用技巧 |
| 2-18 | 奥林巴斯全球用户显微成像案例展示 |
| 19 | 常用培养器具 |
| 20 | 标本放置 |
| 21 | 共聚焦成像对标本的基本要求 |
| 22 | 针孔的作用（Effect of Pinhole） |
| 23 | 章节扉页：正确使用物镜 |
| 24-28 | 物镜详解：分辨率公式、高 NA 物镜、操作规范、校正环 |
| 29 | 章节扉页：使用技巧 |
| 30 | 预览模式 |
| 33-34 | 针孔原理与大小关系 |
| 36 | 激光强度设置 |
| 37-39 | 扫描速度与快速测量 |
| 40 | 亮度补偿（AutoHV） |
| 41 | 多标序列扫描与染料带宽 |
| 42-43 | 扫描分辨率 |
| 44 | 图像放大（ZOOM） |
| 45 | 降低图像噪音（Kalman 滤波） |
| 46-49 | 图像调节（LUT / 增强显示 / 扣除背景） |
| 50 | 采集参数一键调取 |
| 51 | 油镜注意事项 |
| 52 | 关机注意事项 |
| 53 | 维护与保养 |
| 54 | 清洁位置 |
| 55 | 激光安全 |
| 56 | 学习资源推荐 |
| 57 | 谢谢（结束页） |
| 58 | 选择合适荧光染料（Molecular Probes 指南图） |
| 59 | 理想的荧光染料或探针 |
| 60 | 光谱拆分（Unmixing）原理 |
| 61 | 光谱拆分效果对比图 |