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Zeiss LSM 710 SIM 超分辨显微镜操作手册
作者：Matyas Molnar, Biovis, 2016 适用于 Zeiss LSM 710 配置 SIM（结构光照明显微镜）超分辨模块的系统 配套软件：ZEN（black/blue edition）
一、系统组成
| 部件 | 说明 |
|---|---|
| 显微镜镜体 | 激光共聚焦 + SIM 超分辨两用 |
| 激光安全箱 | 采集前确认所有开口关闭 |
| 主开关面板 | Main switch / Systems-PC / Components 三组开关 |
| 荧光灯控制盒 | X-cite 白光荧光灯 |
| Argon 共聚焦激光器 | 独立黑色小盒，钥匙开关 + LASOS 控制面板 |
| SIM 激光盒 (Elyra) | 超分辨专用激光 |
| Real time PC | 右侧实时计算机，死机需按前面板 reset |
| 主计算机 | 左侧，运行 ZEN 软件 |
| 可升降聚光镜 | 明场照明 |
二、开机流程
- 检查显微镜外观是否清洁正常，如有问题记录在日志本
- 打开 Main switch（激光箱面板上）
- 打开 Systems/PC（激光箱面板上）
- 打开 Components（激光箱面板上）
- 打开荧光灯（白色 X-cite 盒子上的按钮）
- 打开左侧主计算机，用个人账号登录
- 等待约 1 分钟系统完全启动
- 启动 ZEN 软件
- 如与 Real time PC 连接失败：整机断电 → 按右侧 PC 前面板 reset 键 → 重启
- 如需使用 Argon 激光器：打开小黑盒钥匙开关 → 将 LASOS 控制面板拨到 “RUN”
三、ZEN 软件 — Locate 定位标签
用于目镜观察样品、快速聚焦和初步查看。
| 功能 | 操作 |
|---|---|
| 明场灯开关 | 透射光开关按钮 |
| 明场光强调节 | 亮度调节旋钮/滑块 |
| 物镜切换 | 物镜转盘 |
| 荧光通道切换 | 注意：Locate 模式下唯一可用的滤镜是 FSet25 HE（三色通道滤镜） |
| 荧光灯开启 | 拨到 ON → 调至至少 12% 强度 → 打开快门 |
四、ZEN 软件 — Acquisition 共聚焦成像
始终勾选 “show all tools” 以显示全部工具面板。
4.1 主要面板
| 面板 | 功能 |
|---|---|
| Smart Setup | 快速设置荧光通道，新手推荐。注意：对多光子激光无效，需手动设置 |
| Acquisition 按钮 | 开始/停止采集 |
| Experiments | 高级成像模式：Z-Stack / Time Lapse / 光漂白 / Tile 扫描 / ROI 成像 |
| Laser menu | 开关 SIM (Elyra) 激光器。HeNe/405nm 常亮，Argon 需在硬件面板开 |
| Acquisition mode | 成像质量设置：分辨率、速度、平均、位深 |
| Imaging setup | 设置激发/发射波长，同时成像/序贯成像切换 |
| Channels | 激光功率 (AOTF)、PMT 增益、数字偏移、针孔大小 |
4.2 Smart Setup 快速通道设置
- 选择荧光染料
- 选择同时成像（simultaneous，快）或序贯成像（sequential，信号好但慢）
- 多光子通道需手动设置
4.3 采集控制按钮
| 按钮 | 功能 | 用途 |
|---|---|---|
| Live | 慢速实时模式 | 找样品位置、粗调焦距、调整强度 |
| Fast Live | 快速实时模式 | 快速浏览、找视野 |
| Snap | 单帧拍摄 | 最终成像 |
| Auto-adjust | 自动曝光 | 快速估算参数 |
4.4 Channels 通道参数调整
- AOTF/Power：激光功率
- Gain：PMT 探测器增益电压
- Digital Offset：背景（暗电平）调整
- Digital Gain：建议忽略（纯数字放大，增加噪声）
- Pinhole：光学切片厚度，点 “1 AU” 获得标准共聚焦
- NDD 多光子：无针孔调节
强度调整最佳实践
- 开启 Range Indicator（底部）：蓝色 = 过暗（像素值 0），红色 = 过曝（超出探测器范围）
- 绝对避免红色过曝区域——信息永久丢失
- 调激光功率或调增益，没有固定规则：高激光+低增益 = 图像质量好、噪声低，但样品易漂白
- 核心原则：质量 vs 时间/漂白的权衡 (COMPROMISE)
- 针孔变化后信号强度会变，需重新调整
4.5 Acquisition Mode 成像模式
| 参数 | 说明 | 建议 |
|---|---|---|
| Scan mode | Spot / Line / Frame | 一般用 Frame |
| X-Y 分辨率 | 图像像素尺寸 | 不确定按 “Optimal”；3D 成像用 512×512 省时间 |
| Scanning speed | 扫描速度 | 越快质量越差，样品依赖，需尝试 |
| Bit depth | 位深 | 需后期处理选 16 bit；一般 8 bit 足够。不影响时间，只影响文件大小 |
| Averaging | 帧/线平均去噪 | 次数越多质量越好但越慢，选 line 或 frame 平均 |
4.6 图像窗口
- Split：通道分色显示
- Gallery：Z 栈/时间序列画廊
- Orthogonal：正交投影（XYZ 三视图）
- 3D rendering：3D 渲染
- Range indicator / Histogram：过曝指示 + 直方图
- Reuse：复用已有采集参数
- Crop：裁剪放大（Live → Stop → Crop → 调框 → 再采集）
五、Z-Stack 三维成像
两种设置方式：
First/Last 方式
- Live 模式下找到样品一端 → Set First
- 找到另一端 → Set Last
- 设置切片数：Interval（间距）或 Slice（总数），不确定按 Optimal
- 优化所有通道针孔（仅 LSM 模式有效）
- 深层样品可设梯度强度补偿
- 点 Start Experiment 开始采集
Center 方式
- 找到样品中心 → Set Center
- 设总切片数 + 间距（上下均分），Optimal 自动计算
- 优化针孔
- Start Experiment
六、Tile Scan 大图拼接
- 可设置水平/垂直 tile 数量，围绕当前位置扩展
- 可旋转样品
- 注意：此设备未购买拼接模块，不能自动拼接，但可在 Contents of image window 模式下导出为单张 TIFF
七、保存与导出
数据不会自动保存，仅在内存中。每次采集后务必保存！按 Live/Snap/Start Experiment 会覆盖未保存数据。
两种保存方式：
| 方式 | 格式 | 用途 |
|---|---|---|
| 完整数据保存 | .czi 或 .lsm | 含全部设置，可重新打开用 Reuse 复用参数。不是通用图像格式 |
| 导出图像 | .tif (推荐) | 可用第三方软件打开、用于发表。导出 “Contents of image window” 即当前所见 |
导出技巧：
- 可关闭不需要的通道、加标尺后导出
- 可导出 Split 模式或 Orthogonal 模式视图
- Z 栈/时间序列可导出为系列单张 TIFF（Contents → series）
八、SIM 超分辨成像
8.1 SIM 成像设置（Acquisition tab）
| 参数 | 说明 | 建议 |
|---|---|---|
| 成像模式 | 切换到 SIM | 确认使用 Elyra SIM 模式 |
| Grid rotation | 光栅旋转角度 | 用 5 次旋转获得最佳结果 |
| 采集模式 | Frame 或 Z-stack | 多通道时必须选 Frame/Z-stack |
| Track 数 | 通道/轨道数 | 按染料数设置 |
| Laser power | 激光功率 | 调整强度的首选参数 |
| Exposure time | 相机曝光时间 | 默认 100 ms，尽量保持 |
| Emission filter | 发射滤镜 | 排除 FSet25 HE（那是 Locate 用的目镜滤镜） |
| 物镜 | 63x/1.4 NA | SIM 必须用此物镜，软件自动选对应光栅 |
8.2 SIM 强度调整
- 使用 16-bit 相机，监控直方图
- 用 Auto contrast (Min/Max / Best Fit) 查看图像（SIM 工作在直方图暗区）
- 正确强度标准：每通道直方图至少有 1000-2000 个值的动态范围；最弱信号至少 256（8 bit）
- 调整策略：先调激光功率，保持 100 ms 曝光。只有出现漂白时才降低激光、增加曝光（会大幅增加成像时间）
九、SIM 图像处理
采集后先保存 .czi 再处理。先自动处理，不满意再手动微调。
自动处理
- 切到 Processing 标签
- 选 Structured Illumination
- 选要处理的数据集
- 输出选 SR-SIM（另一选项是反卷积）
- Apply 等待处理
手动处理（消除伪影/像差）
- 先在 Info 标签查看自动处理用了什么参数
- 切换到手动处理模式
- 选择处理的平面（单张或 first-last 范围）
- Z 栈选 3D 模式
- 选择通道
- 关键参数：Noise filter（噪声滤波）——对分辨率和伪影影响最大
- 取消 Auto noise filter
- 自动处理用 -6，若伪影多尝试 -5、-4 等数值降低分辨率（消除伪影）
- 不要改 SR Frequency Weighting
- Baseline shifted/cut：直方图背景处理（Shift 保留全部，Cut 去除背景）
- Fourier space 视图可预览参数效果
SIM 成像建议
- 始终采集小 Z 栈（Center 模式，约 5 层，Optimal 间距）——可补偿焦点漂移
- 采集后 + 处理后都记得保存 .czi，需要的话导出 TIFF
十、关机流程
每次使用后（非当日最后一人）
- 将数据传输到 DATASHARE 计算机（工作站房间），再用 USB 或服务器带走
- 清洁所有物镜、聚光镜、载物台
- 转到最低倍物镜（或空位置）
- 关闭 ZEN 软件，注销账号（不是当日最后一人可让激光器保持开启）
- 填写日志本，记录任何问题
当日最后一人（追加步骤）
- ZEN 中先关闭所有激光器，再关软件
- 关闭 LASOS 控制面板（待机）→ 钥匙关闭 Argon 激光器 → 等待 5 分钟冷却（通风扇自动停）
- 关闭计算机
- 关闭荧光灯（X-cite 白盒）
- 关闭 Components
- 关闭 Systems/PC
- 关闭 Main switch
- 盖上显微镜防尘罩
- 填写日志本
十一、关键要点汇总
- COMPROMISE 原则：成像质量 vs 时间 vs 样品漂白，三者权衡
- 避免过曝（红色 Range Indicator），信息不可逆丢失
- SIM 必须用 63x/1.4 物镜，5 次光栅旋转
- SIM 强度调整先调激光，保持 100ms 曝光
- SIM 处理先自动再手动，Noise filter 是最关键参数
- Z 栈不确定间距就按 Optimal
- 每次采集后立即保存，防止被覆盖
- Argon 激光关机后等 5 分钟冷却再断电
关联笔记
- Zeiss 710 共聚焦显微镜用户指南-康奈尔BRC — 康奈尔版本基础操作
- Zeiss LSM 800 共聚焦显微镜用户指南-IREC成像平台 — LSM 800 + Airyscan
- 徕卡TCS SP8 STED共聚焦显微镜快速操作手册 — Leica STED 超分辨
- 奥林巴斯FV3000共聚焦激光扫描显微镜产品手册 — Olympus 竞品
- 共聚焦软件使用说明-功能模块手册 — 自研共聚焦软件