Olympus FV1000 共聚焦激光扫描显微镜硬件用户手册
Olympus FLUOVIEW FV1000 硬件用户手册，三卷合订本：系统概述（System Overview）、操作准备（Preparation for Operation）、故障问答（Trouble Q&A）。 适用显微镜型号：BX61/62TRF、BX61WIF、IX81F。
一、系统概述（System Overview）
1.1 共聚焦原理
激光扫描显微镜通过物镜将激光束会聚成微小光点，在 XY 方向扫描样品。探测器捕获来自样品的荧光和反射光，在监视器上输出图像。
共聚焦光学的核心是在与焦面光学共轭的位置设置共聚焦针孔（confocal aperture/pinhole），滤除焦平面以外的杂散光，实现对厚样品的光学切片（optical slicing）。普通光学显微镜中，离焦光与焦面成像光重叠，导致整体图像模糊。
透过样品的激光由透射光检测器检测，形成的透射图像不是共聚焦图像，但与荧光共聚焦图像结合可提供非常重要的样品信息。
1.2 FV1000 七大核心特性
| # | 特性 | 说明 |
|---|---|---|
| 1 | 光子计数模式（Photon Counting） | 新增光子计数模式，提高灵敏度和信噪比（S/N），实现定量光强测量。完全消除模拟漂移，支持长时间定量观测。新型宽带前置放大器和处理电路扩展了光子计数的动态范围 |
| 2 | 高速成像（8 fps） | 快速振镜（galvano mirror）实现 8 帧/秒高速成像。XYZ 和 XZ 观测中 Z 系列电机不停顿即可高速采集图像 |
| 3 | 激光强度反馈控制 | 长时间延时观测（time-lapse）中，每路激光强度通过反馈控制稳定输出。结合光子计数功能，确保长时间观测的稳定性和定量性 |
| 4 | 3 荧光通道 + 3 激光 + AOTF（标配） | 三路荧光通道、三路激光器和声光可调滤光器（AOTF），满足多种应用需求 |
| 5 | 全电动扫描单元 + 电动显微镜 | 整个系统电动化，包括光学条件在内的扫描条件可保存和重现 |
| 6 | 扩展激光照射单元（可选） | 配合光子激活（光漂白、光模拟、光解锁 uncaging），可构建细胞功能分析实验系统 |
| 7 | 光谱检测器单元（可选） | 由 2 通道光谱检测器 + 1 通道滤光片组成，可灵活设置检测条件、采集荧光光谱数据、使用荧光分离功能 |
1.3 光路图（Optical Path Diagram）
激光器 → 激光合束器(Laser Combiner) → 振镜(Galvano mirror) → 物镜 → 样品
↓荧光
针孔(Pinhole) ← 二向色镜(DM) ← 物镜返回
↓
分光光栅(Grating) → 狭缝(Slit) → Ch1/VIS / Ch2 / Ch3 检测器
Ch4（附加通道） Barrier filter
- 激发端：UV/VIS/IR 多波长激光经 DM 合束，通过振镜 XY 扫描，经物镜聚焦到样品
- 探测端：荧光返回后经针孔共聚焦滤波，通过光栅分光到不同通道的 PMT 检测器
- 汞灯光源：通过光纤引入落射荧光照明（非共聚焦明场观察用）
1.4 系统配置（System Configuration）
1.4.1 系统组成模块
| 模块类别 | 主要组件 |
|---|---|
| 激光器 | 氩离子激光器（Ar）、HeNe 绿激光、HeNe 红激光、LD405/440 半导体激光器 |
| 激光合束 | Laser Combiner（激光合束器），将多路激光合成到单根光纤 |
| 扫描单元 | Scan Unit（核心），含振镜扫描器和光检测器，分 BX 型和 IX（倒置）型 |
| 显微镜本体 | BX61/62TRF（正置）、BX61WIF（正置水浸）、IX81F（倒置） |
| 检测器 | 荧光检测器（滤光片型 / 光谱型 SPD MBGR）、透射光检测器、非共聚焦检测器 |
| 照明 | 汞灯灯室（Mercury Lamp Housing）+ 光纤落射照明单元（Epi Fiber Illumination Unit） |
| 控制 | System Controller（系统控制器）、PC 接口板、控制箱（UCB） |
| 软件 | 基础软件（Basic Software）、时间序列软件（Time Course）、高级软件（Advanced）、Review Station |
| 其他 | 防震台（Anti-vibration Table）、20” 平板显示器、电源单元 |
1.4.2 系统外观与功能
- 电源单元（Power Supply Unit）：同时控制 FV1000 扫描单元、激光合束器等
- 扫描单元（Scan Unit）：激光扫描显微镜的核心，由扫描器和光检测器组成
- 系统控制器（System Controller）：控制 FV1000 及其图像等
- 激光合束器（Laser Combiner）：将 Ar、HeNe 绿、HeNe 红激光合束到单根光纤
- 透射光检测器：获取透射图像，通过光纤连接到显微镜
- 汞灯电源：反射光照明电源
- 控制箱（Control Box）：控制显微镜
二、操作准备（Preparation for Operation）
2.1 开机流程（Turning the Power On）
步骤 1：打开以下单元电源
- 电源单元 FV10-PSU
- 汞灯电源单元
- 显微镜控制箱 BX-UCB 或 IX2-UCB
步骤 2：打开 PC 和显示器电源
步骤 3：开启激光器
- 氩离子激光（Ar, FV5-LA-MAR）：打开电源开关→风扇启动→钥匙转到 ON 位置→数十秒后起振
- HeNe 绿/红激光（FV5-LA-HEG/HER）：钥匙转到 ON 位置→数十秒后起振
- LD405/440 激光（FV10-LD405/440）：确认远程互锁（interlock）短路插头已连接或互锁已解除→打开电源开关→钥匙转到 ON→快门开关拨到 OPEN
注意：为确保激光输出稳定，建议预热。氩激光预热 10 分钟以上，HeNe 绿/红激光预热 30 分钟以上。
2.2 启动软件（Starting the Software）
- 输入用户名密码登录 Windows（FV10-ASW 用户需管理员权限）
- 双击桌面 [FLUOVIEW] 图标
- 启动需 20-30 秒
注意：软件启动前必须先开显微镜和电源单元。FV10-SW 用户不要在 FLUOVIEW 运行时双击 [FLUOVIEW Setup] 图标。 注意：如果荧光镜单元的手动快门关闭，无法观察图像——将快门滑到打开位置。
2.3 退出软件与关机（Exiting / Turning Off）
- 退出应用软件，关闭 Windows
- 退出后汞灯可能仍照射样品：关闭汞灯电源 / 关闭手动快门 / 关闭荧光镜单元手动快门
- 关激光：氩离子激光需先关钥匙，等风扇自动停止（数分钟）后再关电源开关
2.4 立方替换（Replacement of Cubes）
2.4.1 DM 立方替换（Replacing the DM Cube）
DM 立方（二向色镜立方）用于连接可选 FV10-ASU 辅助扫描单元或 FV10-OPD 非共焦点检测器的光路，需根据观测方法选择。
FV10-ASU 操作步骤：
- 用软件将扫描单元光路设为 LSM 光路
- 松开扫描单元右侧面板下部 4 个盖板固定旋钮，取下盖板
- 用内六角螺丝刀松开导板锁定板螺丝，移动导板锁定板卡入下方销钉后拧紧
- 松开 DM 立方固定螺丝
- 向外拉出 DM 立方插入旋钮，取出 DM 立方
- 插入所需 DM 立方到燕尾槽，拧紧固定螺丝
- 松开导板锁定板螺丝，滑回原位后拧紧
- 装回扫描单元盖板
FV10-OPD 操作步骤：
- 同上步骤 1-5 取出 DM 立方
- 用精密十字螺丝刀松开 DM 压板螺丝，取出 DM 和 DM 压板
- 插入所需 DM（注意正反面：反射面/干涉膜面朝外），拧紧压板螺丝
DM 规格：适用直径 26±0.3 × 38±0.3 mm，厚度 1±0.05 mm
2.4.2 光谱立方替换（Replacing the Spectral Cube）
光谱立方位于 FV10-OPD 外部光电倍增管内，含荧光波形分离二向色镜和屏障滤光片（2 通道），可根据激发波长更换以提高荧光检测效率。
拆卸步骤：
- 松开 FV10-OPD 左侧面板 2 个盖板固定螺丝（带防脱落机构），取下盖板
- 同样松开内部立方盖板固定螺丝，握住盖板旋钮取下立方盖板
- 稍微松开光谱立方固定螺丝，握住光谱立方插入旋钮拉出
自制光谱立方：可将市售屏障滤光片和 DM 安装到光谱立方框架上
- 屏障滤光片：Φ25±0.2 mm，最大厚度 6 mm
- 二向色镜：26±0.3 × 38±0.3 mm，厚度 1±0.05 mm
- 滤光片固定环方向：滤光片厚度 4-6 mm 与 <4 mm 时安装方向不同
- 注意：更换 DM 和屏障滤光片时，注意不要沾染指纹等
2.5 汞灯灯室对中（Centration of Mercury Burner）
本系统通过光导引入汞灯光线，灯室对中方法与标准反射光荧光系统略有不同。
- 将快门完全旋到底遮光（光导断开时内部有自动快门保证安全）
- 从 ULH 支架上取下光导，换上对中靶（centering target）
- 打开快门，对中靶屏幕上可见汞灯电弧像（汞灯开启 5-10 分钟后电弧像稳定）
- 转动灯室上的聚光镜调焦旋钮，使电弧像聚焦
- 后续用灯室对中旋钮和反射镜调焦螺丝对中（同标准反射荧光系统）
- 对中完成后，取下对中靶，接回光导
- 开始观察时，转动聚光镜调焦旋钮使视场亮度最大
汞灯更换前不需要重新对中。
三、故障问答（Trouble Q&A）
13 类常见故障速查表
| # | 故障现象 | 主要原因 | 排查方向 |
|---|---|---|---|
| 1 | 物镜端无激光输出 | 激光未开 / 波长未选 / 手动快门关闭 / 反射镜不在光路 / 物镜不在光路 / 激光强度太低 / ASU/OPD 的 DM 立方不匹配 | 检查激光开启状态、波长选择、快门、物镜位置、DM 立方匹配 |
| 2 | 观察不到荧光图像 | 针孔太小 / DM 不匹配 / 光谱 DM 和屏障滤光片不匹配 / 采集波长设置不对 / 激发波长与染色不匹配 / 未对焦 / PMT 电压太低 / Offset 太大 / 检测器未选 | 针孔→DM→滤光片→波长→PMT→Offset 逐项检查 |
| 3 | 观察不到透射图像 | 透射光检测通道未选 / 显微镜透射光滤光片在光路中 / PMT 电压太低 / Offset 太大 | 选通道、移除滤光片、调 PMT |
| 4 | 图像有干扰 | 安装位置振动过大 / 环境杂散光（荧光灯等） | 联系 Olympus / 调暗室内灯光 |
| 5 | 反射光（激光）进入荧光图像 | 屏障滤光片设置错误或缺失 / 采集波长与激光波长重叠或太近（光谱系统）/ ASU 激光的屏障滤光片未选 | 更换屏障滤光片 / 调整采集波长 |
| 6 | 荧光图像质量差 | 物镜前透镜脏 / 校正环调整不当（带校正环物镜）/ 盖玻片厚度不合适（应用 0.17 mm） | 清洁物镜 / 调整校正环 / 更换盖玻片 |
| 7 | 荧光图像暗且噪点多 | 激光弱 / 染色与激发波长不匹配 / DM 不匹配 / 光谱滤光不匹配 / 采集波长区域不对 / 针孔太小 / 扫描速率太快 / HV 太高 / 采集波长区域宽度太小 / 染色太浅 | 提激光→换 DM→调针孔→降扫描速率→调 HV/Gain→增波长宽度 |
| 8 | 图像不规则模糊或亮度不均 | 样品或载物台倾斜 | 正确安装样品和载物台 |
| 9 | 观察图像失焦 | 焦点调节不当 | 目视观察时调焦 |
| 10 | 光谱特征数据部分波长区域强度下降 | 双激发中激发 DM 光谱特性影响荧光光谱 | 使用不影响荧光光谱特征数据的激发 DM |
| 11 | 出现 Flare（杂光/光晕） | 使用的玻璃不是无荧光玻璃 / 样品过度染色 | 换无荧光玻璃 / 优化染色或增加 Offset |
| 12 | 目视荧光观察不可能 | 扫描单元（SU）光路选择器未设为目视观察 / 汞灯快门关闭 / 照明器转塔中无含 DM 的镜单元 | 选目视光路 / 开汞灯快门 / 装入含 DM 的镜单元 |
| 13 | ASU（附加扫描单元）激光不输出 | ASU 组合 DM 立方特性与激光波长不匹配 / ASU 组合 DM 立方不在光路中 | 换匹配的 DM 立方 / 将 DM 立方装入光路 |
若以上方法无法解决问题，请联系 Olympus 维修。
四、关键技术要点总结
光子计数模式（Photon Counting）的意义
FV1000 的核心差异化技术。传统模拟检测存在漂移问题，不适合长时间定量观测。光子计数直接计数光子事件，完全消除模拟漂移，配合激光强度反馈控制，实现长时间延时观测的稳定定量测量。新型宽带前置放大器扩展了动态范围上限。
AOTF（声光可调滤光器）的作用
标配三路激光 + AOTF，可快速切换和调节各激光强度，无需机械换片，适合多色荧光成像和快速波长切换实验。
全电动化的价值
扫描单元和显微镜全电动化，所有光学条件（针孔、DM、滤光片、物镜等）可保存和调用，保证实验可重复性——这是高端研究级共聚焦的标配。
可选扩展模块
| 模块 | 功能 | 应用 |
|---|---|---|
| ASU 辅助扫描单元 | 额外激光照射（光激活/漂白/uncaging） | 细胞功能分析、FRAP、光遗传学 |
| 光谱检测器单元（SPD MBGR） | 2 通道光谱检测 + 1 通道滤光片 | 荧光光谱采集、多色荧光分离 |
| 时间序列软件 | Time Course 时间序列观测 | 活细胞长时间成像 |
关联笔记
- Olympus FV1000 共聚焦显微镜硬件手册（上一册，已处理）
- 奥林巴斯 FV3000 共聚焦激光扫描显微镜产品手册（同系列新型号）
- Zeiss 710 共聚焦显微镜用户指南-康奈尔BRC（竞品对比）
- Zeiss LSM 800 共聚焦显微镜用户指南-IREC成像平台（竞品对比）
- 徕卡 TCS SP8 STED 超高分辨共聚焦显微镜快速操作手册（竞品对比）
- 共聚焦软件使用说明-功能模块手册（配套软件）
- 共聚焦显微镜操作软件需求说明（项目需求参考）