Nikon A1R 共聚焦显微镜用户手册（Joe Dragavon 版）
来源：141124_A1R_Manual_Web.pdf，41 页，2014 年 12 月 12 日版。 编制：Joe Dragavon（办公室 C315，电话 (303) 735-6988）。 设备：Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜 + Nikon Elements 软件 + Ti-E 倒置显微镜 + PFS 完美聚焦系统。 定位：面向用户操作手册，从开机到多维采集的完整操作指南，含 GUI 介绍、通用操作流程、ND 多维采集、PFS、技巧与故障排除。
一、文档概览
共 7 大部分：
| 部分 | 标题 | 页码 | 核心内容 |
|---|---|---|---|
| 1 | General Procedures | 2-5 | 开机/关机流程、环境箱开关 |
| 2 | Introduction to Nikon Elements GUI | 6-8 | GUI 8 大面板介绍 |
| 3 | General Operating Procedure | 9-19 | 从初始化到拍照的完整操作流程（8 步） |
| 4 | Multidimensional Acquisitions (ND) | 20-28 | Lambda/Z-stack/Multipoint/Time-Lapse/Large Image + 实验顺序 |
| 5 | Perfect Focus System | 29-32 | PFS 原理、操作、与 Z-stack 结合 |
| 6 | Tips and Tricks | 33-40 | 大图扫描/Mouse XY&Z/ROI/Line Profile/Ratio View/放大镜/复用设置 |
| 7 | Trouble Shooting | 41 | 5 类常见故障 |
二、通用流程（General Procedures）
2.1 开机流程（Nikon A1R Startup Procedure）
- 打开两个电源插排（1 和 2）
- 将激光箱钥匙转到 On 位置（3）
- 打开计算机（4）
- 打开 LED 光源，先 BACK 后 FRONT（5）
- 启动 Nikon Elements
- 提示时选择 “Nikon Confocal”，按 OK（无密码）
- 再次提示时选择 “Nikon Confocal”，按 OK
- 开始成像
联系人：Joe Dragavon，办公室 C315，电话 (303) 735-6988
2.2 关机流程（Shutdown Procedure）
- 保存图像并传输到共享盘
- 退出 Nikon Elements，断开共享盘
- 取下样品，清洁显微镜（擦油、关环境箱）
- 打开预约日历：**1 小时内有下一个用户 → 跳到第 9 步（不关激光）；超过 1 小时 → 继续第 5 步
- 激光箱钥匙转到 Off 位置
- 关计算机
- 关 LED 光源，先 FRONT 后 BACK
- 激光风扇停止后，关两个电源插排
- 下一个用户来时如果关
2.3 环境箱（Environmental Chamber / Live Cell）
- **开机：
- 加湿瓶装 DI 水（最多到 MAX FILL 线）
- 打开 LiveCell Controller Unit（背面）
- 按绿色 SEL 按钮验证设置
- 按绿色方块按钮初始化控制器
- 打开气瓶（如需要的气瓶
- 放置环境箱，使用正确的载物台插入件
- 平衡 30 分钟
⚠️ 警告：加湿控制启用时绝对不能在加湿瓶中没有水的情况下运行系统！
- 关机：
- 取下环境箱
- 关闭加湿控制器（需等待湿度降到 25% 以下）
- 关闭其余控制器
- 关气瓶
- 关 LiveCell Controller Unit
三、Nikon Elements GUI 8 大面板
| 编号 | 面板 | 功能 |
|---|---|---|
| 1 | Image Viewing Panel | 显示采集的图像 |
| 2 | OC Panel | 预定义光学配置（共聚焦/明场/目镜模式） |
| 3 | Ti Pad | 显微镜直接控制显微镜（DIA 灯、物镜等） |
| 4 | Filters, Shutters, Switchers | 开关落射荧光快门（Epi） |
| 5 | Histogram & LUT | 直方图 + 与查找表（亮度对比度调节） |
| 6 | A1plus Compact GUI | 激光扫描共聚焦核心控制（激光选择、功率、PMT 增益） |
| 7 | A1Plus Scan Area | 扫描区域大小、像素步长 |
| 8 | ND Acquisition | 多维采集（时间序列/Z栈/多点/大图） |
四、通用操作流程（8 步法）
步骤 1：初始化 GUI
- 在 OC Panel 中选择 4Ch + DIC 配置，系统会重置 A1plus Compact GUI 为默认设置。
步骤 2：选择物镜
Ti Pad 面板中点击物镜。5 个可用物镜：
| 位置 | 放大倍率 | NA | 浸没 | 工作距离 | 特性 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 10x | 0.5 | Air | 4000 µm | Plan Apo λ |
| 2 | 20x | 0.8 | Air | 1000 µm | Plan Apo λ |
| 3 | Empty | — | — | — | — |
| 4 | 40x | 1.3 | Oil | 200 µm | Plan Fluor DIC H N2 |
| 5 | 100x | 1.5 | Oil | 130 µm | Plan Apo λ |
| 6 | 100x TIRF | 1.5 | Oil | 130 µm | Plan Fluor DIC H N2 |
⚠️ 注意：
- 不要在空气物镜（10x、20x）上加油！
- 油不要加太多，一小滴足够，否则会进入物镜内部导致损坏（物镜价格 11,000）
- 小心不要让物镜碰到盖玻片或载物台
步骤 3：验证荧光团 & 对焦
- 明场目镜观察：OC Panel → 488 Widefield Eyes 配置 → A1plus Compact GUI → Eye Port
- 回到共聚焦模式：取消 Eye Port → 选择 4Ch + DIC
- 远红染料（如 Cy5.5）没有对应的目镜滤光片组
步骤 4：调节激光功率和 PMT
- 每次只调一个激光（减少光漂白），从最亮的荧光团开始
- 按 Scan 开始实时扫描
- 打开 Continuous Autoscale 按钮
像素饱和检测（两种方法）：
- Histogram 面板右上角出现圆圈 = 有饱和像素
- Pixel Saturation Indication 按钮（或 Ctrl+Shift+S）= 饱和像素显示为互补色（绿色中粉色、蓝色中白色等）
针孔（Pinhole）设置：
- 1 AU（2）= 真正的共聚焦
- 1.2 AU = 共聚焦性和信号的良好折中
- Nikon A1R 所有激光共用一个针孔，建议用488nm 或 561nm 设置针孔计算
推荐调节工作流：
- 选择针孔计算用的激光，调整针孔
- HV（增益）设为 100
- 调整激光功率直到没有饱和像素
💡 最佳实践：高增益 + 低激光功率（增益 4 比反之。增益在 80–120 之间（>120 会放大噪声），激光功率在 1–5 之间（取决于荧光团强度）。
Offset 设置：
- 降低背景像素值，尽可能接近 0，但不要到 0（0 值不真实数据）
- 像素值为 0 会导致比值计算等数学问题
欠饱和像素：
- 直方图左上角有圆圈，或图像中显示蓝色
- 同样要避免
步骤 5：保存配置到 4Ch + DIC
- 修改后配置旁出现红色感叹号（!）表示已修改
- 按配置右边的小白箭头注册修改保存
- 不注册的话切换配置会丢失
每个激光线都重复以上步骤重复一次，最后激活所有激光，注册修改，采集图像。
步骤 6：可选）：调整 XY 像素尺寸
默认 512×512。提高图像帧。两种方法提高采样率：
- Nyquist XY 按钮：自动计算最佳采样步长（最佳空间分辨率）
- 手动调整：Zoom 因子或拖动扫描区域角落
- 扫描区域指示器框变红后右键接受修改。
步骤 7：通道序列（Channel Series）
- 默认同时采集所有通道（最快）。
- 光谱串扰（spectral bleed through）问题时使用 Channel Series：逐行扫描。
- DAPI 强信号弱 GFP 通道中可以单独采集。
- 每个通道独立采集，或配对采集。
- Ch Series 图标在 A1plus Compact GUI 中。
步骤 8：捕获和保存图像
- **Scan 按钮：连续采集（再按一次停止）
- **Capture 按钮：单次采集（独立窗口）
- 捕获的图像**不会自动保存
五、多维采集（ND Acquisition）
5.1 Lambda（λ）- 多光学配置
- 定义和使用多个光学配置。
- 只使用已注册的配置（红色感叹号的修改不生效）。
- 可以添加多个配置。
- **必须设置 Path 和 Filename（ND 模式下图像会自动保存）。
5.2 Z-Stacks
三种定义方式：
- 定义顶部和底部（Top and Bottom）
- 对称 Z 栈（Symmetric）
- 非对称 Z 栈（Asymmetric）
公共参数：
-
Step：步长（µm）
-
Steps：总步数
-
Z Device：Ti ZDrive（最常用）/ Step-by-step Piezo Z / Piebo Z Drive（需压电 Z 载物台插入件）
-
Nyquist Z 按钮：自动调整步长和步数。
Top/Bottom 设置步骤 操作步骤（12 步）**：
- 选最左边 Z stack 图标（定义顶/底）
- 按 Reset 按 Reset
- 选 Z Device（通常 Ti ZDrive）
- 找到中心对焦平面
- 只留一个通道（最重要的那个），不要注册更改
- 选单次 Autoscale
- 按 Scan
- 往上调焦到图像几乎看不见 → 标记 Top
- 往下调焦到图像几乎看不见 → 标记 Bottom
- 停止 Scan，重新激活所有激光
- 定义 Step 步长或步数
- 按 Run Now
5.3 Multipoint XY
- 保存多个感兴趣区域位置
- XY 选项卡下管理
- 可包含 Z 位置
- 移动载物台到新位置 → + Add 添加点
5.4 Time-Lapse Imaging
4 个参数段：
- Phase：时间序列阶段（可多个阶段，一个接一个
- Interval：一个图像周期长度
- Duration：阶段总时长
- Loops：间隔数
例：1-2 小时间隔 15 分钟，第 2 小时 5 分钟间隔，减少光毒性。
时间单位可切换：s/ms/m/h。
- No delay + Continuous = 尽快采集直到手动停止
- No Acquisition = 不采集只计时
5.5 Large Image（大图拼接/拼接）
- 以中心点定义的图像矩阵
- 1 field = 1 次采集
- Overlap 重叠率（通常 10%）
- Stitching 拼接：需要足够细节才能正确对齐
- Do Not Stitch：不拼接，每个图像文件
- 可与 Multipoint 结合使用，类似高内涵筛选（HCS）
5.6 ND Acquisition 实验顺序
- 从内到外（从右到左），像数学运算括号
- 例：Z series(Lambda(Large Image)) → 先大图，再换 Lambda，最后 Z 栈
- 步数指示：T(时间)/M(多点)/Z(Z栈)/λ(Lambda)/L(大图)
六、完美聚焦系统（PFS）
6.1 原理
- 近红外 LED + 线 CCD 检测盖玻片表面反射
- 保持盖玻片和物镜之间距离恒定
- 大大减少 Z 漂移（长时间成像和大图扫描
6.2 适用与不适用
| 适用 | 不适用 |
|---|---|
| 活细胞样品（低折射率培养基，如细胞培养液 / PBS） | 固定样品（高折射率封片剂，如 Prolong Gold，折射率 1.41–1.49，与玻璃 1.5255 太接近） |
| 低倍空气物镜（10x、20x） | 高倍油浸物镜（40x、100x）+ 高折射率封片剂 |
- 水折射率 1.33，DMEM+10%FBS 1.34 → 反射强
6.3 操作
- 显微镜上按钮 或 Ti Pad 中激活
- 激活后蜂鸣，绿灯常亮 = 找到盖玻片；闪烁 = 未找到
- 找到后 Z 轮禁用，必须用 PFS 控制器调节
- PFS Offset 控制器调节偏移透镜位置 → 物镜位置
6.4 PFS + Z-stack
- 必须用对称 Z 栈
- Z 栈期间 PFS 会暂时脱离，采集完重新接合
- 适合长时间 Z 栈成像
七、技巧与窍门（Tips and Tricks）
7.1 Scan Large Image（快速大图扫描）
- Acquire 菜单 → Scan Large Image
- 不用 ND Acquisition 面板的大图扫描
- 可设置当前位置为中心或左上角
- 与 PFS 配合效果好
- ⚠️ 确认物镜和 Ti Pad 中选的一致
7.2 Move to Center / Mouse XY / Mouse Z
- Move to Center：右键大图 → Move this Point to Center → 载物台自动移动到该点居中
- 可直接 Add to ND Acquisition（多点 XY）
- Mouse XY：实时扫描时移动载物台（左键拖动）
- Mouse Z：左键激活后滚轮调节 Z（比 Z 轮更精细）
7.3 ROI & Line Profile
- ROI：右键长按出菜单（矩形/多边形/圆形）→ 实时荧光强度分析
- 或侧边栏第二个方块下拉箭头
- Line Profile：侧边栏第 7 个图标（正弦波形）→ 强度分布曲线，可导出
7.4 Ratio View（比值视图）
- 时间序列采集时实时像素级比值图像
- 右键底部信息栏空白处 → Ratio View
- Ratio Properties 设置分子/分母/色阶
7.5 Magnifying Glass（放大镜）
- 左侧工具栏放大镜图标 或 按”z”键
- 左键点击图像放大
- 按”p”键切回指针
- 特别适合大图扫描图像
7.6 Reuse System Settings（复用系统设置）
- 打开以前采集的图像 → 右键 → Reuse 选项：
- Reuse Camera Settings
- Reuse Device Settings
- Reuse ND Setup
- 没有”全部复用”选项，需要分别选 3 次
八、故障排除（Trouble Shooting）
| 问题 | 排查方向 |
|---|---|
| 明场无激发光 | LED 灯是否打开（前后都开）、Epi 快门是否打开、液波导（黑色电缆）是否就位（滑出来了就轻轻推回去，别太用力） |
| 激光无激发光 | 激光钥匙是否打开、是否在共聚焦模式、光路是否指示 L100 端口 |
| 大图扫描不对 | 物镜校准丢失 → 联系 Joe Dragavon |
| Mouse XY 移动不稳 | 物镜校准丢失 → 联系 Joe Dragavon |
| 其他问题 | 联系 Joe Dragavon |
九、与其他 Nikon A1/A1R 手册的关系
本手册是Joe Dragavon 编写的机构内部用户操作指南，侧重侧重操作流程导向，与其他 Nikon A1/A1R 手册互补：
- 与 Nikon A1R共聚焦显微镜用户操作手册（12 页 cheat sheet 风格）→ 更精简快速参考
- 与 Nikon A1共聚焦显微镜简易操作手册（88 页官方 Ver4.10）→ 更全面的官方手册
- 与 Nikon A1R激光共聚焦扫描显微镜操作指南（上海科技大 29 页中文）→ 中文视角
- 本手册特色：PFS 详细讲解 + ND Acquisition 实验顺序 + 大量实操技巧是亮点
关键要点速查
- 针孔：1 AU 标准，1.2 AU 折中
- 增益范围：80–120（>120 噪声大）
- 激光功率：1–5（常规
- **Z 栈 Nyquist 按钮自动计算步长
- PFS 只适用于活细胞/低折射率培养基
- **ND 实验顺序从内到外（右到左）
- **修改配置后必须注册（红色感叹号要消除）
- **环境箱加湿瓶必须有水！