JJF 1527-2015 聚合酶链反应分析仪校准规范
基本信息
- 规范编号：JJF 1527—2015
- 中文名称：聚合酶链反应分析仪校准规范
- 英文名称：Calibration Specification for Polymerase Chain Reaction Analyzers
- 发布日期：2015-06-15
- 实施日期：2015-09-15
- 发布机构：国家质量监督检验检疫总局
- 归口单位：全国生物计量技术委员会
- 主要起草单位：中国计量科学研究院
- 参加起草单位：上海市计量测试技术研究院、广东省计量科学研究院、天津市计量监督检测科学研究院
- 主要起草人：高运华（中国计量科学研究院）
- 性质：首次发布的国家计量技术规范
引用文件
- GB/T 6682—2008《分析实验室用水国家标准》
- YY/T 1173—2010《聚合酶链反应分析仪》（行业标准，见 YY-T-1173-2010聚合酶链反应分析仪行业标准）
- JJF 1030—2010《恒温槽校准规范》
- SN/T 2102.1—2008 / ISO 22174:2005《食源性病原体PCR检测技术规范 第1部分：通用要求及定义》
- SN/T 2102.2—2008 / ISO 20836:2005《食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分：PCR性能试验要求》
适用范围
适用于模块加热的聚合酶链反应（PCR）分析仪计量性能的校准。 其他类型的PCR仪可参照执行。
术语定义
聚合酶链反应（PCR）
一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性→退火→延伸三个基本反应步骤构成。
聚合酶链反应分析仪
基于PCR技术原理，模拟DNA或RNA的复制过程，在模板、引物、聚合酶等存在的条件下，特异扩增已知序列并对其进行检测分析的仪器设备。
仪器分类与组成
定性PCR仪
由样品载台、热循环部件、控制部件、电源部件组成。
定量PCR仪
由样品载台、热循环部件、控制部件、光学检测部件、电源部件、计算机及应用软件组成。
计量特性总表
| 校准项目 | 定性PCR仪 | 定量PCR仪 | 说明 |
|---|---|---|---|
| 温度示值误差 | ✅ | ✅ | 6个温度点（30/50/60/70/90/95℃） |
| 温度均匀度 | ✅ | ✅ | 同一温度下孔间温差 |
| 平均升温速率 | ✅ | ✅ | 50℃→90℃区间 |
| 平均降温速率 | ✅ | ✅ | 90℃→50℃区间 |
| 样本示值误差 | ❌ | ✅ | 标准物质比对 |
| 样本线性 | ❌ | ✅ | 系列稀释Ct值线性回归 |
校准条件
校准设备及标准物质
| 设备/物质 | 要求 |
|---|---|
| 温度校准装置 | 15个精密温度传感器+数据采集模块，测温范围0～120℃，测量不确定度≤0.1℃，需计量检定 |
| 标准物质 | 质粒DNA或核糖核酸有证标准物质，拷贝数≥10⁹ copies/μL，相对扩展不确定度≤5% |
| 电子天平 | 精度≤0.01 mg，需计量检定 |
| 移液器 | 2/10/100/200/1000 μL规格，需计量检定 |
环境条件
仪器使用允许的环境条件，测量过程中应测量和记录环境温度、相对湿度。 校准前开机预热30 min。
校准方法
一、温度示值误差
布点：96孔加热模块中布置15个温度传感器，其他型号参照执行。
温控程序（8步）：
| 步骤 | 设定温度 | 持续时间 |
|---|---|---|
| 1 | 30℃ | 1 min |
| 2 | 95℃ | 3 min |
| 3 | 30℃ | 2 min |
| 4 | 90℃ | 3 min |
| 5 | 50℃ | 3 min |
| 6 | 70℃ | 3 min |
| 7 | 60℃ | 3 min |
| 8 | 30℃ | 1 min |
计算公式：
温度示值误差 ΔTd = Ts - Tc平均
Tc平均 = (1/n) × ΣTi （i=1到n）
其中：
ΔTd — 温度示值误差，℃
Ts — 设定温度值，℃
Tc平均 — 所有传感器测量值的平均值，℃
Ti — 第i个传感器测定值，℃
二、温度均匀度
温度均匀度 ΔTu = Tmax - Tmin
其中：
Tmax — 所有传感器测定值的最大值，℃
Tmin — 所有传感器测定值的最小值，℃
三、升降温速率
温控程序（3步循环）：45℃ 3min → 95℃ 3min → 45℃ 3min
平均升温速率（取50℃→90℃区间，恒温10s后开始计时）：
VUT = (TB - TA) / t
其中：
VUT — 平均升温速率，℃/s
TA — 50℃温度点测量值，℃
TB — 90℃温度点测量值，℃
t — 从TA到达TB的时间，s
平均降温速率（取90℃→50℃区间）：
VDT = (TB - TA) / t
其中：
VDT — 平均降温速率，℃/s
TA — 50℃温度点测量值，℃
TB — 90℃温度点测量值，℃
t — 从TA到达TB的时间，s
四、样本示值误差（定量PCR仪）
标准物质配制：S₀（1×10⁹ copies/μL）逐级10倍稀释至S₇（1×10² copies/μL），共7个梯度。
未知样品：以S₃为起点配制U₁（5.0×10⁵ copies/μL）和U₂（2.5×10⁵ copies/μL）。
96孔校准板：包含U₁、U₂、S₁～S₇、NTC（阴性对照）、NIM等。
温度循环程序（45个循环）：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 1 | 50℃ | 2 min | 1 |
| 2 | 95℃ | 10 min | 1 |
| 3 | 95℃ | 30 s | 45 |
| 4 | 60℃ | 1 min | 45 |
样本示值误差计算：
Δc = cc平均 - cs
其中：
Δc — 样本示值误差，copies/μL
cc平均 — 仪器测量平均值，copies/μL
cs — 标准物质标称值，copies/μL
五、样本线性（定量PCR仪）
以系列稀释的标准物质（至少5个浓度）扩增Ct值与浓度对数值进行线性回归，计算线性回归系数 r。
标准物质梯度稀释表
| 样品 | 取原液(mg) | 加水(mg) | 终浓度(copies/μL) |
|---|---|---|---|
| S₁ | 100 (S₀) | 900 | 1×10⁸ |
| S₂ | 100 (S₁) | 900 | 1×10⁷ |
| S₃ | 100 (S₂) | 900 | 1×10⁶ |
| S₄ | 100 (S₃) | 900 | 1×10⁵ |
| S₅ | 100 (S₄) | 900 | 1×10⁴ |
| S₆ | 100 (S₅) | 900 | 1×10³ |
| S₇ | 100 (S₆) | 900 | 1×10² |
PCR反应体系（50μL）
| 试剂 | 终浓度 | 体积 |
|---|---|---|
| ddH₂O | - | 20.6 μL |
| 10×PCR buffer | 1× | 5 μL |
| 25 mmol/L MgCl₂ | 2.5 mmol/L | 5 μL |
| dNTPs | 0.2 mmol/L | 4 μL |
| 10 μmol/L Probe | 0.2 μmol/L | 1 μL |
| 10 μmol/L Primer 1 | 0.4 μmol/L | 2.0 μL |
| 10 μmol/L Primer 2 | 0.4 μmol/L | 2.0 μL |
| 5 U/μL Taq enzyme | 0.04 U/μL | 0.4 μL |
| DNA模板 | - | 10.0 μL |
| 总计 | - | 50 μL |
注：若Mg²⁺、dNTPs、Taq已包含在10×buffer中则不需再加；使用2×buffer时调整加样体积。
不确定度评定
温度示值误差不确定度（附录C）
两大来源：
- 测量重复性引入的不确定度 u₁
- 标准温度传感器引入的不确定度 u₂
扩展不确定度（k=2）示例：
| 温度(℃) | 重复性SD(℃) | 合成不确定度(℃) | 扩展不确定度U(℃) |
|---|---|---|---|
| 30 | 0.3 | 0.25 | 0.5 |
| 50 | 0.2 | 0.21 | 0.5 |
| 60 | 0.3 | 0.22 | 0.5 |
| 70 | 0.4 | 0.32 | 0.7 |
| 90 | 0.6 | 0.51 | 1.1 |
| 95 | 0.6 | 0.60 | 1.2 |
规律：温度越高，不确定度越大（95℃时达1.2℃），主要贡献来自重复性。
样本示值误差不确定度（附录D）
见附录D（本笔记未详细展开，核心来源为标准物质不确定度+测量重复性+移液器不确定度等）。
校准结果表达与复校
- 校准证书：符合JJF 1071—2010中5.12要求，给出校准项目名称、测量值及扩展不确定度
- 复校时间间隔：建议不超过1年，用户可根据实际使用情况自行确定
关键数据速查
- 温度校准点：6个（30/50/60/70/90/95℃）
- 温度传感器数量：15个
- 升温速率计算区间：50℃ → 90℃
- 降温速率计算区间：90℃ → 50℃
- 样本线性最少浓度梯度：5个
- 定量PCR循环数：45个
- 标准物质梯度：7级（10⁹ → 10² copies/μL）
- 反应体系体积：50 μL
关联笔记
- YY-T-1173-2010聚合酶链反应分析仪行业标准 — 产品行业标准，本规范的引用文件之一
- 多重定量PCR系统中多色荧光检测和光谱串扰校正方法-臧留琴 — 四色荧光串扰校正算法研究
- 荧光溢出补偿-数字PCR多色荧光检测校正技术 — 数字PCR荧光溢出补偿技术
- 数字PCR荧光检测仪数据分析方法的设计与实现-李鑫鑫-硕士论文 — 数字PCR数据分析与k-means聚类
笔记说明
- 原文件为扫描版PDF（20页），通过pdftoppm渲染+视觉分析逐页提取
- 完整覆盖9章正文+6个附录的核心内容
- 重点整理：计量特性6项指标、校准方法与公式、标准物质配制、反应体系、不确定度评定