JJF (苏) 222-2019 实时荧光定量 PCR 仪校准规范
江苏省地方计量技术规范，2019年发布实施，是国内首个省级实时荧光定量PCR仪校准规范。
一、基本信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 规范编号 | JJF（苏）222—2019 |
| 中文名称 | 实时荧光定量PCR仪校准规范 |
| 英文名称 | Calibration Specification for Real-Time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction Analyzer |
| 发布机构 | 江苏省市场监督管理局 |
| 发布日期 | 2019-05-09 |
| 实施日期 | 2019-09-01 |
| 归口单位 | 江苏省市场监督管理局 |
| 主要起草单位 | 江苏省计量科学研究院、南京信息职业技术学院、江苏省人民医院 |
| 参加起草单位 | 南京鼓楼医院、广东省计量科学研究院、南京明瑞检测技术有限公司 |
| 解释权 | 江苏省医学计量专业技术委员会 |
| 总页数 | 31页（含封面、目录、正文、附录） |
| 性质 | 首次发布的地方计量技术规范 |
二、编制依据与引用文件
编制依据
- JJF 1071-2010《国家计量校准规范编写规则》
- JJF 1001-2011《通用计量术语及定义》
- JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》
主要参考文件
| 编号 | 名称 |
|---|---|
| JJF 1101-2003 | 环境试验设备温度、湿度校准规范 |
| JJF 1527-2015 | 聚合酶链反应分析仪校准规范（国家级） |
| YY/T 1173-2010 | 聚合酶链反应分析仪（行业标准） |
| SN/T 2102.1-2008 / ISO 22174:2005 | 食源性病原体PCR检测技术规范 第1部分：通用要求及定义 |
| SN/T 2102.2-2008 / ISO 20836:2005 | 食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分：PCR性能试验要求 |
| CLSI MM03-P2 | 传染病的分子诊断方法：建议指南——第二版 |
| Hendrikx M T. (2014) | Calibration device for a thermal cycler |
与JJF 1527-2015 国家级规范的关系：本规范在国家级规范基础上，增加了光学系统物理校准方法（基于PCR扩增光学模拟器），以及溶解温度漂移、溶解温度比、通道峰值高度一致性、线性灵敏系数等特色校准参数，内容更全面。
三、适用范围
- 适用对象：实时荧光定量PCR仪（RTFQ-PCR仪）的校准
- 参照适用：其他类型PCR仪相同原理部分可参照执行
四、术语与定义（20个核心术语）
4.1 基础概念类
| 术语 | 英文 | 定义要点 |
|---|---|---|
| 聚合酶链反应 | polymerase chain reaction (PCR) | 对特定DNA/RNA片段体外快速扩增的方法，由变性→退火→延伸三步构成 |
| 聚合酶链反应分析仪 | PCR analyzer | 基于PCR技术原理，模拟DNA/RNA复制过程，特异扩增已知序列并检测分析的仪器设备 |
| 实时荧光定量PCR | real-time fluorescent quantitative PCR (RTFQ-PCR) | 在PCR过程中利用荧光染料释放的荧光能量变化直接反映扩增产物量，通过荧光采集分析对原始模板量进行定量。每个循环监测扩增产物。 |
| 荧光染料 | fluorochrome | 由短波长激发光激发、释放可见光的试剂。常见：FAM、HEX、Texas Red、VIC、Cy3、ROX、量子点等 |
4.2 温度性能类
| 术语 | 英文 | 定义要点 |
|---|---|---|
| 温度示值误差 | temperature indication error | 温控装置显示平均值与实际温度平均值之差，单位℃ |
| 温度均匀度 | temperature uniformity | 温控装置内温度的均匀程度，单位℃ |
| 温度波动度 | temperature volatility | 温控装置在一定时间间隔内温度变化的范围，单位℃ |
| 温度过冲量 | temperature shoot | 温度升高或降低至规定值时，在规定温度允差范围内超出规定温度的量，单位℃ |
| 平均升温速率 | mean heating rate | 升温过程中模块单位时间上升的平均温度，单位℃/s |
| 平均降温速率 | mean cooling rate | 降温过程中模块单位时间下降的平均温度，单位℃/s |
4.3 光学性能类
| 术语 | 英文 | 定义要点 |
|---|---|---|
| 荧光强度精密度 | precision of fluorescence intensity | 多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度测量值的一致性 |
| 阈值循环数Ct(cp) | threshold cycle (crossing point) | 荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。计算方式：扩增前3~15个循环荧光值的10倍标准差为阈值，超过阈值时的循环数即为Ct值 |
| Ct值精密度 | precision of threshold cycle | 多个检测孔在同一荧光条件下重复Ct值测量值的一致性 |
| 溶解温度 | melt temperature (Tm) | DNA双螺旋结构降解一半时的温度，不同序列的DNA，Tm值不同 |
| 溶解温度漂移 | melt temperature bias (ΔTm) | 同一溶解温度在不同通道发生漂移形成多峰的现象，用ΔTm表示。可能与温控系统有关，也可能与荧光检测系统有关，或两者都有关 |
| 溶解曲线 | melt curve | PCR扩增完成后，通过逐渐增加温度同时监测荧光信号产生的曲线。用荧光信号改变的负一次导数与温度作图，在Tm值上有特征峰 |
| 峰值高度 | peak heights | 溶解曲线上扩增产物的溶解温度对应特征峰的高度。不同峰值高度说明荧光检测系统有缺陷 |
| 通道峰值高度一致性 | channel peak height consistency (CPHC) | 不同检测孔在同一溶解温度对应峰值高度的一致性。理想值=1；<1表示荧光灵敏度降低（Ct值升高）；>1表示荧光灵敏度增加（Ct值降低） |
| 线性灵敏系数 | linear sensitivity factor (LSF) | 将线性变化灵敏程度数字化的物理量。理想值=1；0.8~1.2为良好；<0.8高荧光强度信号饱和；>1.2低荧光强度灵敏度不足 |
| 溶解温度比 | ratio of melt temperature (RTm) | 将溶解温度漂移因素数字化的物理量。=1时漂移来自温度系统；>1超差时漂移同时来自温度和光学系统；<1超差时漂移来自光学系统 |
五、仪器原理与构成
5.1 工作原理
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知浓度DNA进行定量分析。
PCR扩增理论方程：
- Xₙ = X₀ × (1+En)ⁿ （X₀为起始模板数，En为扩增效率，n为循环数）
- 达到荧光阈值时：X_Ct = X₀ × (1+En)^Ct = M（常数）
- 对数转换后：Ct = -k·Lg(X₀) + b（k、b为与扩增效率有关的常数）
- 模板DNA量越多，Ct值越小；Lg模板起始浓度与Ct值呈线性关系
- 扩增效率 E = 10^(-1/slope) - 1
- 一般PCR扩增效率在**90%~110%**可用于数据分析
- 效率低于100%：存在抑制因素
- 效率高于100%：可能有污染、非特异性扩增或引物二聚体
5.2 仪器组成
主要由五大部分组成：
- 样品载台
- 基因扩增热循环组件（温度控制系统）
- 微量荧光检测光学系统（荧光检测系统）
- 微电路控制系统
- 计算机及应用软件
核心部分：温度控制系统 + 荧光检测系统 + 计算机控制系统
六、计量特性指标（核心）
注：以下技术指标不是用于合格性判别，仅供参考。
6.1 温度类参数
| 计量特性 | 温度点 | 指标要求 |
|---|---|---|
| 温度示值误差 | 30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃ | ±0.5℃ |
| 温度均匀度 | 30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃ | ≤1.0℃ |
| 温度波动度 | 95℃ | ≤1.0℃ |
| 温度波动度 | 30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃ | ≤0.2℃ |
| 温度过冲量 | 95℃、50℃ | ≤3.0℃ |
| 平均升温速率 | 50℃~90℃ | ≥1.5℃/s |
| 平均降温速率 | 90℃~50℃ | ≥1.5℃/s |
6.2 光学与仪器性能参数
| 计量特性 | 指标要求 | 说明 |
|---|---|---|
| Ct值示值误差 | ±2.5 | 物理方法测量 |
| Ct值均匀度 | ≤5 | 物理方法测量 |
| Ct值精密度 | ≤10% | 物理方法测量，用RSD表示 |
| 通道峰值高度一致性 (CPHC) | ±0.2 | 理想值为1 |
| 线性灵敏系数 (LSF) | ±0.2 | 理想值为1 |
| 溶解温度漂移 (ΔTm) | ±1℃ | |
| 溶解温度比 (RTm) | ±0.2 | 理想值为1 |
| 荧光强度精密度 | ≤5% | 生物化学方法 |
| 样本精密度 | ≤5% | 生物化学方法 |
| 荧光线性相关系数 | ≥0.990 | 生物化学方法 |
| 样本线性相关系数 | ≥0.980 | 生物化学方法 |
七、校准条件
7.1 环境条件
- 环境温度：(10~30)℃
- 相对湿度：(30~75)%RH
- 其他：仪器应远离振动、电磁干扰
7.2 校准设备和试剂
| 类别 | 设备/试剂 | 规格要求 |
|---|---|---|
| 核心校准装置 | PCR扩增光学模拟器 | 温度传感器(0 |
| 标准物质 | 质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质 | 拷贝数≥10⁶ copies/μL，相对扩展不确定度≤5% |
| 荧光染料 | FAM、HEX、Texas Red、VIC、Cy3、ROX、量子点等 | — |
| 移液器 | 2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL | 需经过计量校准 |
| 诊断试剂 | 仪器配套诊断试剂 | 按说明书储存，在有效期内 |
核心创新点：PCR扩增光学模拟器——同时实现光学系统校准和温度系统校准。温度传感器监测温度循环变化，驱动发射光发生器发射光强度增强，模拟仪器扩增过程。
八、校准项目与方法
8.1 校准项目分类
校准项目分为物理方法和生物化学方法两大类，根据客户要求和现场实际可选择其中一种。
物理方法项目（基于PCR扩增光学模拟器）：
- 温度示值误差、温度均匀度、温度波动度、温度过冲量
- 平均升温速率、平均降温速率
- Ct值示值误差、Ct值均匀度、Ct值精密度
- 通道峰值高度一致性、线性灵敏系数
- 溶解温度漂移、溶解温度比
生物化学方法项目（基于标准物质和染料）：
- 荧光强度精密度
- 样本精密度
- 荧光线性相关性
- 样本线性相关性
8.2 校准前准备
- 将仪器及PCR扩增光学模拟器各部件连接完好
- 在温度传感器表面涂抹适量导热油
- 96孔PCR仪参照布点图放置温度传感器和校准单元，确保与加热模块接触良好
- 其他型号PCR仪可参照布点
8.3 参考程序（16步）
| 步骤 | 设定温度 | 持续时间 | 备注 |
|---|---|---|---|
| 1 | 30℃ | 60s | 预热程序 |
| 2 | 95℃ | 60s | |
| 3 | 30℃ | 60s | |
| 4 | 30℃ | 60s | 温度控制程序 |
| 5 | 95℃ | 180s | |
| 6 | 30℃ | 120s | |
| 7 | 90℃ | 180s | |
| 8 | 50℃ | 180s | |
| 9 | 70℃ | 180s | |
| 10 | 60℃ | 180s | |
| 11 | 30℃ | 180s | 光学扩增程序，重复32个循环 |
| 12 | 85℃ | 1s | |
| 13 | 60℃ | 30s | |
| 14 | 95℃ | 15s | 溶解曲线控制程序 |
| 15 | 60℃ | 30s~95s | |
| 16 | 95℃ | 15s |
8.4 各项目计算方法
| 项目 | 计算公式 | 符号说明 |
|---|---|---|
| 温度示值误差 | ΔT_d = T_s - (1/n)ΣT_i | T_s设定温度，T_i第i个传感器测定值 |
| 温度均匀度 | ΔT_u = T_max - T_min | 所有测温传感器最大值减最小值 |
| 温度波动度 | ΔT_f = ±½(T_fmax - T_fmin) | 中心位置3min内最高最低温差的一半 |
| 温度过冲量 | ΔT_o = T_omax - T_s | 过冲温度最大值减设定值 |
| 平均升温速率 | V_UT = (T_B - T_A) / t | 30℃→95℃的平均速率 |
| 平均降温速率 | V_DT = (T_B - T_A) / t | 95℃→30℃的平均速率 |
| Ct值示值误差 | ΔCt = ΣC_tij - ΣC_tis | 仪器Ct值减模拟器Ct值 |
| Ct值均匀度 | ΔC_tu = C_tmax - C_tmin | 最大Ct值减最小Ct值 |
| Ct值精密度 | RSD_Ct = RSD × 100% | Ct值的相对实验标准偏差 |
| 通道峰值高度一致性 | CPHC = (B - C) / I | B/C为Tm+2℃时单通道荧光，I为平均荧光 |
| 线性灵敏系数 | LSF = (A - B) / (B - C) | A为最高荧光，B/C为Tm+2℃时荧光 |
| 溶解温度漂移 | ΔTm = Tm_t - Tm_s | 模拟器设定值减仪器测量值 |
| 溶解温度比 | RTm = (Tm_max - Tm_min) / (t_max - t_min) | 仪器Tm极差 / 温度传感器温度极差 |
| 荧光强度精密度 | RSD_F = RSD × 100% | 高/中/低浓度各测1次，≥6孔 |
| 样本精密度 | RSD_St = RSD × 100% | 高/中/低浓度DNA各6孔 |
| 荧光/样本线性相关系数 | r = Pearson相关系数 | 至少5个梯度，每浓度3次重复 |
九、校准结果表达
9.1 校准证书要求
- 校准后填发校准证书
- 符合JJF 1071—2010中5.12的要求
- 给出各校准项目名称、测量结果以及扩展不确定度
- 校准原始记录格式见附录A
9.2 测量不确定度
- 按JJF 1059.1—2012的要求评定
- 示值误差的不确定度及评定示例见附录C
十、复校时间间隔
- 由仪器使用情况、使用者、仪器本身质量等因素决定
- 送校单位可根据实际使用情况自主决定
- 建议不超过1年
十一、附录
| 附录 | 内容 |
|---|---|
| 附录A | 校准原始记录（参考）格式 |
| 附录B | 校准证书结果页（参考）格式 |
| 附录C | 温度和Ct值测量结果的不确定度评定示例 |
附录A 原始记录内容
- 仪器基本信息表（名称、型号、厂商、编号、委托单位等）
- 温度示值误差和温度均匀度记录表（6个温度点，16个传感器位置）
- 温度波动度记录表（6个温度点，6次测量）
- 温度过冲量、平均升/降温速率记录表
- Ct值示值误差、均匀度、精密度记录表（物理方法）
- 通道峰值高度一致性、线性灵敏系数、溶解温度漂移、溶解温度比记录表（物理方法）
- 荧光强度精密度记录表（生物化学方法，高/中/低三值）
- 样本精密度记录表（生物化学方法，高/中/低三值）
附录C 不确定度评定示例
附录C给出了温度和Ct值测量结果的不确定度评定示例，包括：
- 标准不确定度分量一览表
- 合成标准不确定度计算
- 扩展不确定度计算（取k=2）
- 以分光光度计发光强度为例：Ur=9.5%(k=2)，计算合成不确定度
十二、与其他规范的对比
| 对比项 | JJF 1527-2015（国家级） | JJF（苏）222-2019（江苏地方） |
|---|---|---|
| 发布机构 | 国家质检总局 | 江苏省市场监督管理局 |
| 适用范围 | 聚合酶链反应分析仪（普通PCR+实时荧光） | 实时荧光定量PCR仪 |
| 校准方法 | 温度校准为主，荧光检测功能检查 | 温度校准 + 光学校准（物理/生化两种方法） |
| 特色参数 | 6项计量特性（温度示值误差、均匀度、升降温速率、示值误差、线性相关系数、精密度） | 20个术语定义+15+项校准参数，含溶解温度漂移、溶解温度比、CPHC、LSF等特色参数 |
| 校准装置 | 温度校准装置 | PCR扩增光学模拟器（温度+光学一体化） |
| 总页数 | 20页（扫描版，9章正文+6附录） | 31页（9章正文+3附录） |
十三、关键价值点
- 国内首个省级实时荧光定量PCR仪校准规范，填补地方规范空白
- 首创物理方法校准：基于PCR扩增光学模拟器，无需生物试剂即可完成光学校准
- 两套校准方法体系：物理方法（快速、无生物危害）+ 生物化学方法（准确、需标准物质），可按需选择
- 特色参数丰富：CPHC、LSF、RTm等参数可定位故障来源（温控系统 vs 荧光检测系统）
- 完整的不确定度评定示例：为实际校准工作提供参考
- 与国家级规范JJF 1527-2015互补：内容更全面，参数更丰富，方法更灵活
关联笔记：
- JJF1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范（国家级规范，本规范主要参考之一）
- YY-T-1173-2010聚合酶链反应分析仪行业标准（行业标准，术语与性能指标依据）
- 四色荧光DNA测序自动矩阵确定算法-Yin-1996（荧光串扰校正算法参考）
- li1999-四色荧光DNA测序串扰矩阵估计-Li-Speed-1999（荧光串扰校正算法参考）
- 荧光溢出补偿-数字PCR多色荧光检测校正技术（数字PCR荧光补偿技术）