JJF (津) 04-2020 实时荧光定量PCR仪校准规范
天津市地方计量技术规范，2020年发布实施，适用于实时荧光定量聚合酶链反应分析仪的校准。
基本信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 规范编号 | JJF (津) 04—2020 |
| 中文名称 | 实时荧光定量PCR仪校准规范 |
| 英文名称 | Calibration Specification for Real-Time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction Analyzer |
| 性质 | 天津市地方计量技术规范（首次发布） |
| 发布机构 | 天津市市场监督管理委员会 |
| 主要起草单位 | 天津市计量监督检测科学研究院 |
| 参加起草单位 | 军事医学研究院医学计量测试研究站、国家体育总局体育科学研究所、北京林电伟业电子技术有限公司 |
| 发布日期 | 2020年5月18日 |
| 实施日期 | 2020年6月30日 |
| 总页数 | 27页（含附录） |
| 编制依据 | JJF 1071-2010《国家计量校准规范编写规则》、JJF 1001-2011《通用计量术语及定义》 |
| 不确定度依据 | JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》 |
| 计量特性参考 | YY/T 1173-2010《聚合酶链反应分析仪》 |
适用范围
- 适用于实时荧光定量聚合酶链反应分析仪（RT-PCR analyzer）的校准
- 该类仪器通过实时监测PCR进程的荧光信号强度，结合标准曲线对扩增基因做定量分析
仪器概述
工作原理
标记荧光染料的探针与模板基因混合，经高温变性→低温复性→适温延伸的热循环后，与模板互补配对的探针被切断，荧光染料游离于反应体系；特定光激发下荧光染料发光，随着循环次数增加，目的基因片段呈指数增长，实时检测对应荧光信号强度即可完成待测基因定量。
仪器组成
- 温度控制模块
- 微量荧光检测模块
- 均热块（32孔/48孔/96孔/384孔，96孔最广泛）
- 电脑控制系统
- 计算机及应用软件
计量性能指标（16项）
一、温度项目（5项）
| 序号 | 项目 | 测试温度点 | 技术指标 |
|---|---|---|---|
| 1 | 温度示值误差 | 30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃ | ±0.5℃ |
| 2 | 温度均匀度 | 30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃ | ≤1.0℃ |
| 3 | 温度最大过冲量 | 30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃ | ≤3.0℃ |
| 4 | 平均升温速率 | 50℃→90℃ | ≥1.5℃/s |
| 5 | 平均降温速率 | 90℃→50℃ | ≥1.5℃/s |
二、光学系统物理项目（7项）
| 序号 | 项目 | 技术指标 |
|---|---|---|
| 6 | 阈值循环数（Ct）示值误差 | ±2.5 |
| 7 | 阈值循环数均匀度 | ≤5 |
| 8 | 阈值循环数精密度 | ≤10% |
| 9 | 通道峰值强度一致性（CPHC） | ±0.2 |
| 10 | 线性灵敏系数（LSF） | ±0.2 |
| 11 | 熔解温度漂移 | ±1℃ |
| 12 | 熔解温度比（RTm） | ±0.2 |
三、光学系统生物化学项目（4项）
| 序号 | 项目 | 技术指标 |
|---|---|---|
| 13 | 荧光强度精密度 | ≤5% |
| 14 | 样本测量精密度 | ≤3% |
| 15 | 荧光线性相关系数 | ≥0.990 |
| 16 | 样本线性相关系数 | ≥0.980 |
校准条件
环境条件
- （规范未在已分析页面中给出具体数值，通常参照常规计量实验室环境）
测量标准和其它设备
| 类别 | 要求 |
|---|---|
| 光学模拟器 | 用于物理校准方法，模拟PCR扩增的荧光信号 |
| 标准物质 | 国内外有证标准物质（质粒DNA、核糖核酸），拷贝数≥10⁹ copies/μL，相对扩展不确定度≤5% |
| 移液器 | 2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL，需计量检定合格 |
校准方法选择（二选一）
- 光学系统物理校准方法：校准项目 = 温度项目 + 光学系统物理项目
- 光学系统生物化学校准方法：校准项目 = 温度项目 + 光学系统生物化学项目
采样测量孔分布（7孔）
96孔板中选取7个光学模拟器位置：A1、A7、A12、D7、H1、H7、H12
校准程序（16步）
第一组：预热程序（步骤1-3）
| 步骤 | 温度 | 维持时间 |
|---|---|---|
| 1 | 30℃ | 60s |
| 2 | 95℃ | 60s |
| 3 | 30℃ | 60s |
第二组：温度技术指标校准程序（步骤4-11）
| 步骤 | 温度 | 维持时间 | 说明 |
|---|---|---|---|
| 4 | 30℃ | 60s | 升温起点 |
| 5 | 95℃ | 180s | 升温速率测量（4→5） |
| 6 | 30℃ | 120s | 降温速率测量（5→6）；30℃指标测量 |
| 7 | 90℃ | 180s | 90℃指标测量 |
| 8 | 50℃ | 180s | 50℃指标测量 |
| 9 | 70℃ | 180s | 70℃指标测量 |
| 10 | 60℃ | 180s | 60℃指标测量 |
| 11 | 30℃ | 180s | — |
第三组：模拟光学扩增程序（步骤12-13）
| 步骤 | 温度 | 维持时间 | 说明 |
|---|---|---|---|
| 12 | 85℃ | 10s | 循环32次，同步光学检测 |
| 13 | 60℃ | 30s | — |
第四组：扩增变性程序（步骤14）
| 步骤 | 温度 | 维持时间 |
|---|---|---|
| 14 | 95℃ | 15s |
第五组：熔解曲线分析程序（步骤15-16）
| 步骤 | 温度 | 维持时间 |
|---|---|---|
| 15 | 60℃ | 30s |
| 16 | 95℃ | 15s |
核心计算公式
温度类
温度示值误差：ΔT = T_s - (1/7)ΣT̄_i
温度均匀度：ΔT_u = T̄_umax - T̄_umin
温度最大过冲量：ΔT_os = |T_osmax - T_s|
平均升温速率：V_UT = (T̄_B - T̄_A) / t_UT （50℃→90℃）
平均降温速率：V_DT = (T̄_B - T̄_A) / t_DT （90℃→50℃）
阈值循环数类
Ct示值误差：ΔC_ti = C_tqi - C_ts
Ct均匀度：ΔC_tu = C_tqmax - C_tqmin
Ct精密度：RSD_Ct = 相对标准偏差（n=7孔）
熔解曲线类
通道峰值强度一致性：CPHC_i = (B_i - C_i) / (B̄ - C̄)
- B_i = (Tm-2)℃处荧光强度
- C_i = (Tm+2)℃处荧光强度
线性灵敏系数：LSF_i = (A_i - B_i) / (B_i - C_i)
- A_i = Tm℃处荧光强度
熔解温度漂移：ΔTm_i = Tm_i - Tm_s
熔解温度比：RTm = (Tm_max - Tm_min) / (t_max - t_min)
线性与精密度类
荧光强度精密度：RSD_F = 相对标准偏差（n≥6孔，高/中/低三浓度）
样本测量精密度：RSD_S = 相对标准偏差（每浓度6孔重复）
荧光线性相关系数：r_F = Pearson相关系数（≥5个浓度梯度，n=3重复）
样本线性相关系数：r_S = Pearson相关系数（≥5个浓度梯度，n=3重复）
校准结果表达
校准证书应包含以下信息：
- 标题”校准证书”
- 实验室名称和地址
- 校准地点
- 证书唯一性标识（编号）+ 页码标识
- 客户名称和地址
- 被校对象描述和明确标识
- 校准日期
- 校准依据的技术规范标识
- 测量标准的溯源性及有效性说明
- 校准环境描述
- 校准结果及其测量不确定度说明
- 对校准规范的偏离说明
- 签发人签名、职务
- 校准人和核验人签名
- 校准结果仅对被校对象有效的声明
- 未经批准不得部分复制的声明
复校时间间隔
建议复校间隔：1年
附录
| 附录 | 内容 |
|---|---|
| 附录A | 荧光定量PCR仪校准原始记录参考格式 |
| 附录B | 荧光定量PCR仪校准证书内页参考格式 |
| 附录C | 温度示值误差和阈值循环数示值误差测量结果的不确定度评定示例 |
附录C：不确定度评定示例（Ct值）
- 不确定度来源：测量重复性 u₁、光学模拟器分辨力 u₁’、标准器具引入 u₂
- 测量方案：同条件下10次重复测量，7个采样孔
- 标准不确定度分量：
- u₁（重复性）= 0.099，灵敏度系数 1
- u₂（光学模拟器）= 0.546，灵敏度系数 -1
- 合成标准不确定度：u_c = √(u₁² + u₂²) = 0.555
- 扩展不确定度：U = k × u_c = 1.2（k=2，约95%置信水平）
与JJF1527-2020国标的对比
| 对比项 | JJF 1527-2015（国标） | JJF (津) 04-2020（天津地方） |
|---|---|---|
| 发布年份 | 2015 | 2020 |
| 温度指标数量 | 5项（示值误差/均匀度/过冲/升/降温速率） | 5项（相同分类） |
| 温度示值误差 | ±0.5℃ | ±0.5℃ |
| 光学校准项目 | 区分物理/生化方法 | 区分物理/生化方法（二选一） |
| 采样孔数 | 96孔板选9孔（3×3布局） | 96孔板选7孔（A1/A7/A12/D7/H1/H7/H12） |
| 特色参数 | — | 通道峰值强度一致性（CPHC）、线性灵敏系数（LSF）、熔解温度比（RTm） |
注：天津地方规范新增了熔解曲线相关的特色校准指标（CPHC、LSF、RTm），更强调熔解曲线分析性能的定量评价。采样孔布局采用7孔对角线式分布。
关联笔记
- YY-T-1173-2010聚合酶链反应分析仪行业标准 — 行业产品标准，本规范的计量特性参考依据
- JJF1527-2015 聚合酶链反应分析仪校准规范 — 国家计量校准规范
- JJF-苏222-2019实时荧光定量PCR仪校准规范 — 江苏省地方校准规范
- 荧光溢出补偿-数字PCR多色荧光检测校正技术 — 荧光串扰校正技术文档
- 多重定量PCR系统中多色荧光检测和光谱串扰校正方法-臧留琴 — 四色荧光串扰校正论文