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EP 2 475 788 B1 - 多重核酸扩增光谱串扰补偿

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EP 2 475 788 B1 - 多重核酸扩增光谱串扰补偿

专利基本信息

项目内容
专利号EP 2 475 788 B1（欧洲专利）
申请号10815913.8（PCT/US2010/047265）
申请日2010.08.31
授权公告日2018.04.25
专利权人DiaSorin S.p.A.（意大利萨卢贾）
发明人Peter D. Ludowise（美国明尼苏达州圣保罗）
国际公布WO 2011/031585（2011.03.17）
优先权US 241307 P（2009.09.10）、US 358287 P（2010.06.24）
IPC分类C12Q 1/68
总页数69 页
文档性质欧洲专利说明书（B1 授权文本）

核心技术问题

光谱串扰（Spectral Crosstalk）：在多重核酸扩增（如多重实时 PCR）中，由于荧光染料的吸收光谱和发射光谱较宽，相邻检测通道之间会产生信号串扰。强扩增信号的串扰会在邻近通道上产生虚假的增长曲线，可能被误判为阳性结果（false positive）。

传统方法使用光学滤光片来最小化信号串扰，但滤光片只能减少而无法完全消除串扰。

核心发明思路

通过校准过程确定一组串扰校正因子，然后用算法自动从目标通道信号中扣除相邻通道的串扰信号量，从而减少或消除假阳性判定。

关键创新点

  1. 使用真实扩增数据做校准：用单重（single-plex）实时 PCR 反应的实际扩增数据来定量串扰程度，而不是用纯染料溶液的光谱数据。因为探针标记后，寡核苷酸结构会改变荧光团周围的电子密度，导致光谱红移，且偏移量因探针序列而异。

  2. 最近光谱邻居（Nearest Spectral Neighbor）：优先只校正最近的光谱邻居（峰值波长差最小的染料对），而非全矩阵校正，降低计算复杂度。也可扩展为多个邻居（峰值差小于阈值距离，如 50 nm）。

  3. 校正因子基于扩增期斜率比：从单重反应的指数增长期数据计算校正因子，使用信号的基线扣除后值的比值。

校正算法流程

第一步：校准（Calibration）—— FIG. 24 流程

对每种目标探针/染料分别进行单重实时 PCR 反应：

  1. 单重反应：每个探针单独做 real-time PCR，所有通道同时采集信号（即使只有一个靶标存在）
  2. 基线扣除：对每个通道做背景噪声扣除（Equation 1）
  3. 计算校正因子：对每个通道 i，计算其光谱邻居 j 的串扰校正因子 cor_i
  4. 多周期平均：取 Ct 之后 3-5 个周期起的若干周期（如 30-35 周期或 35-50 周期）的校正因子取平均值
  5. 存储参数：将平均后的校正因子存入内存，供后续多重反应使用

第二步：应用校正—— FIG. 25 流程

对多重 PCR 数据：

  1. 初始化 PCR 扩增，载入校正因子参数
  2. 采集各通道扩增数据
  3. 应用串扰校正（Equation 6）：
    • 校正后信号 = 背景校正信号_i - cor_ij x 背景校正信号_j
    • 其中 i 为目标通道，j 为最近光谱邻居通道
  4. 显示校正后的数据和扩增曲线

四通道校正因子示例（FAM/JOE/TxRed/Cy5 体系）

  • FAM 通道 <- JOE 通道串扰（最近邻居）
  • JOE 通道 <- FAM 通道串扰（最近邻居）
  • TxRed 通道 <- Cy5 通道串扰（最近邻居）
  • Cy5 通道 <- TxRed 通道串扰（最近邻居）

实测校正因子示例（Example 2）：

  • cor_FAM = 0.09408（JOE 对 FAM 的串扰系数）
  • cor_JOE = 0.06402（FAM 对 JOE 的串扰系数）
  • cor_TxRed = 0（TxRed 通道串扰可忽略）
  • cor_Cy5 = 0.1202（TxRed 对 Cy5 的串扰系数）

阈值判定方法

专利中还提到了多种 Ct 值/阈值判定方法：

  1. 手动阈值法：用户设定阈值荧光强度，软件找扩增曲线与阈值交点的周期
  2. 自动阈值法：基线区域平均值 + N 倍标准差（如 5 倍标准差）作为阈值
  3. 小波变换法：对扩增曲线做小波变换，找频率分量幅值最大的周期作为 Tmax（对应 WO 2009/132268 专利）
  4. 傅里叶变换法（对应 US 2006/0286587）
  5. 双 S 型拟合法（对应 US 2007/0143385）

硬件平台

该专利的应用场景是 DiaSorin 的圆盘式多重荧光检测设备（可插拔光学模块架构）：

  • 检测盘（disk）：离心式微流控盘，包含多个反应腔，激光阀控制系统
  • 光学模块：可插拔设计，每个模块对应一个染料（LED + 激发滤光片 + 二向色镜 + 检测滤光片 + 透镜）
  • 单检测器架构：多通道通过光纤束（fiber optic bundle）耦合到单个 PMT 检测器
  • 模块数量：示例为 4 通道，可扩展
  • 条形码读取器：识别盘类型

适用范围

不仅限于 PCR，可扩展到其他核酸扩增技术：

  • TMA（转录介导扩增）
  • NASBA（核酸序列依赖性扩增）
  • LCR（连接酶链反应）
  • SDA（链置换扩增）

与其他串扰校正方法的对比

方法特点本专利方法
纯染料光谱校准简单，但未考虑探针标记后光谱偏移使用真实探针的扩增数据校准
全矩阵补偿（流式细胞术 Bagwell 法）精度高，计算量大可选择只校正最近邻居，降低复杂度
聚类分析法（Yin 1996, Huang 1997, 臧留琴 2014）无需单重校准，从数据中自动估计不同思路，需足够信号强度
最小二乘法（CN101688841A 罗氏专利）全采集范围最小二乘估计本专利用扩增期斜率比，更简单

关联文献

重要引文

  • Bagwell et al. (1993)：Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters — 流式细胞术全参数光谱重叠补偿方法，本专利的方法学基础之一
  • Verwer / BD FACSDiVa：BD 公司的流式细胞仪补偿方案白皮书
  • WO 2009/132268：用小波变换分析核酸扩增曲线（同公司关联专利）
  • US 7,507,575：可插拔光学模块的多重荧光检测设备（硬件基础专利）

关系图谱

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