CN101688841A - 用于确定PCR和其他数据集中的串扰系数的系统和方法

专利类型：发明专利申请公布（PCT进入中国国家阶段） 公开号：CN 101688841A 申请号：200880022522.4 申请人：霍夫曼-拉罗奇有限公司（瑞士巴塞尔） 发明人：R·T·柯尼克、A·萨尼、C·埃尔金 申请日：2008年6月27日 公开日：2010年3月31日 优先权：2007年6月29日美国申请 60/947,065 国际公布：WO2009/003645（2009年1月8日，英文） 总页数：33页（权利要求书3页 + 说明书18页 + 附图11页 + 其他） 文件来源：/工作相关/QPCR(1)/01 数据处理模块——串扰分析与数据转化/

一、技术领域

本发明涉及处理S形/生长曲线（尤其是PCR曲线）数据的系统和方法，具体涉及确定PCR检测系统串扰特性的系统和方法。

适用范围不仅限于PCR：还可应用于细菌生长过程、核酸解链过程、酶动力学反应、结合过程等任何具有类似S形/生长曲线特征的数据。

二、背景技术与现有技术缺陷

2.1 PCR基础

PCR是酶合成/扩增特定核酸序列的体外方法
由「模板变性 → 引物退火 → 引物延伸」的重复循环组成
使用荧光探针/荧光染料实现扩增过程的检测与量化
典型设备：Roche Diagnostics LightCycler

2.2 PCR曲线三区特征

区域	特征
基线区	荧光信号无明显增长的初始阶段
生长区	产物指数增长阶段（基线区与平稳区之间）
平稳区（plateau）	扩增效率下降、荧光信号趋于平稳

2.3 串扰问题来源

多通道PCR检测系统配置2个及以上滤波器，每个滤波器隔离特定波长范围的辐射。

串扰成因：荧光探针/标记物的发射波长带存在部分重叠，滤波器带通范围覆盖重叠区域，导致每个检测信道接收到其他探针发射的信号，干扰目标真实信号的检测准确性。

2.4 常规串扰方法的三大缺陷

数据利用率低：仅使用平稳区数据（占总数据量<10%）计算串扰系数，且平稳区信号化学性质不稳定、噪声大
假设不成立：假设存在平坦低噪声平稳期，但多数数据集无法同时满足”有平稳期+平坦+噪声最小”三个条件
模型不准确：使用线性加法模型，假设所有源测量信号符合线性加法模型、所有信号可在检测器间解析，导致信号过修正或欠修正

三、发明核心技术方案

3.1 两大核心创新点

全范围串扰系数确定：使用整个信号采集范围（基线区+生长区+平稳区）的数据，通过最小化基本信号与串扰信号之间的平方和来确定串扰系数，更鲁棒
线性减法模型：摒弃常规线性加法模型，改用线性减法模型应用串扰系数，更贴合实际检测系统特性

最佳适用场景：串扰系数在2%或更大范围的应用

3.2 总体流程（过程100）

步骤110 — 针对每个检测信道，采集PCR实验数据集（覆盖全采集范围）
步骤120 — 针对每个其他信道，在相同采集范围上同时采集串扰数据集
步骤130 — 处理两类数据集，确定串扰系数（最小化平方和或绝对值之和）
步骤140 — 对PCR数据集应用串扰系数，生成串扰修正的数据集
步骤150 — 存储和/或显示数据

四、串扰系数计算的三种模型

核心思想：通过最小化采集范围内信号与串扰信号之间的平方和求解串扰系数。

模型1：单增益简单校正（实施例1）

方程：

$min [\sum_{i} (X T S i g na l_{i} - q \times S i g na l_{i})^{2}]$

参数	含义
$i$	循环数索引
$S i g na l_{i}$	基本信号（PCR数据集）在第 $i$ 点的值
$X T S i g na l_{i}$	串扰信号在第 $i$ 点的值
$q$	乘性增益因子（即串扰系数）

特点：模型最简单，仅考虑乘性串扰增益。

模型2：全局增益+多通道独立增益校正（实施例2）

所有信道共享偏移 $r$ 和斜率 $s$ ，每个信道有独立的乘性增益 $q$ 。

以3个信道为例：

\begin{gathered} \left(XTSignal1_{i} - (r + s \times i + q1 \times Signal_{i})\right)^2 + \\ \left(XTSignal2_{i} - (r + s \times i + q2 \times Signal_{i})\right)^2 + \\ \left(XTSignal3_{i} - (r + s \times i + q3 \times Signal_{i})\right)^2 \end{gathered} \right]\right]$$ | 参数 | 含义 | |------|------| | $r$ | 所有信道共有的偏移量 | | $s$ | 所有信道共有的线性斜率 | | $q1, q2, q3$ | 各信道独立的乘性增益 | **特点**：适用于多通道串扰场景，共享偏移和斜率参数，减少待求参数数量。 ### 模型3：全参数独立校正（实施例3） 每个信道有独立的偏移$r$、斜率$s$、乘性增益$q$。 **方程**： $$\min\left[\sum_{i}\left(XTSignal_{i} - (r + s \times i + q \times Signal_{i})\right)^2\right]$$ **特点**：单通道场景下校正精度最高，参数最多。 ### 模型对比总结 | 模型 | 待求参数 | 精度 | 适用场景 | |------|----------|------|----------| | 单增益 | 1个（q） | 低 | 简单校正、串扰较小 | | 全局增益 | 2+n个（r,s + q1..qn） | 中 | 多通道、系统偏移一致 | | 全参数独立 | 3个/通道（r,s,q） | 高 | 单通道高精度、各通道差异大 | ### 其他可选优化方法 除最小二乘法外，还可使用： - 最小化绝对值之和（L1范数） - Levenberg-Marquardt方法 - 线性规划 - Nelder-Mead方法 - 梯度下降法、次梯度法 - 牛顿法、拟牛顿法 - 内点方法等 --- ## 五、线性减法串扰修正模型 确定串扰系数后，使用线性减法模型生成串扰修正的数据集。 ### 基础线性减法模型 $$f_{ic} = f_i - \left(\sum_{j \neq i} a_{ij} \times f_j\right)$$ | 参数 | 含义 | |------|------| | $f_i$ | 信道$i$中测量的原始信号 | | $f_{ic}$ | 信道$i$中串扰修正后的信号 | | $a_{ij}$ | 从信道$j$到信道$i$的串扰系数 | ### 全局增益线性修正模型 $$f_{iC} = f_i - \left(\sum_{j \neq i} a_{ij} \times f_j\right) - (r + s \times i)$$ 增加所有信道共有的增益$r$和线性项$s$。 ### 单信道独立增益修正模型 $$f_{iC} = f_i - \left(\sum_{j \neq i} a_{ij} \times f_j\right) - (r_i + s_i \times i)$$ 每个信道有独立的增益$r_i$和线性项$s_i$。 --- ## 六、预处理步骤 在确定串扰系数前，对数据集执行三类预处理： ### 6.1 背景相减 通过减去每个信道特有的缓冲信号完成。 ### 6.2 基线相减 确定基线后从所有信号中减去。基线的两种定义方式： - **线性回归法**：指定基线开始值、终止值，对两端点之间数据做线性回归 - **曲线拟合法**：对双S形函数进行曲线拟合，得到的斜率和截距作为基线参数 ### 6.3 异常点（尖峰）去除 从PCR数据集和串扰数据集中去除异常点/尖峰。 > 参考两件相关美国专利申请： > - "Levernberg Margquardt Outlier Spike Removal Method"（序列号11/316,315） > - "PCR Elbow Determination By Use of a Double Sigmoid Function Curve Fit With the Levenberg-Marquardt Algorithm and Normalization"（序列号11/349,550） --- ## 七、系统架构 ### 7.1 动力学PCR系统组成 - **光学检测模块**：包含至少两个光学元件（滤波器/衍射光栅），每个隔离不同波长范围 - 采集PCR数据集 - 同步采集串扰数据集 - **智能模块**：处理数据、确定串扰系数 - 可集成在PCR装置中 - 也可为独立计算机系统 ### 7.2 数据传输方式 | 时机分类 | 方式分类 | |----------|----------| | 实时提供（采集同步传输） | 直连传输（USB、有线/无线） | | 事后提供（存储后传输） | 网络传输（LAN、VPN、内联网、因特网） | | | 便携介质（CD、DVD、软盘） | --- ## 八、与同目录其他文献的关联 - **[[荧光溢出补偿-数字PCR多色荧光检测校正技术]]**：同目录中文综述，介绍数字PCR荧光溢出补偿的工程实现，本专利为底层算法原理 - **[[多重定量PCR系统中多色荧光检测和光谱串扰校正方法-臧留琴]]**：《光学学报》2014年论文，磁光开关+PMT四色荧光检测光路+四维聚类分析迭代串扰校正，与本专利全范围最小二乘思路类似但具体算法不同 - **[[四色荧光DNA测序自动矩阵确定算法-Yin-1996]]**：Yin & Smith 1996年经典论文，四维球坐标聚类+无监督光谱解混，从测序领域迁移到PCR串扰校正 - **[[li1999-四色荧光DNA测序串扰矩阵估计-Li-Speed-1999]]**：Li & Speed 1999年论文，迭代式L1回归+散点图臂斜率估计，无需基线扣除 - **[[huang1997-四色荧光测序滤波器矩阵迭代聚类估计-Huang-Fuhrmann]]**：Huang et al. 1997年论文，迭代聚类+Kullback I-divergence+第五簇去噪 **对比观察**：本专利（罗氏）的核心创新是将串扰系数计算从"平稳区单点比值"扩展到"全曲线最小二乘拟合"，这与测序领域Yin 1996/Huang 1997/Li 1999等从单基到全序列聚类估计的技术演进路径高度一致，都是从单点估计→全范围拟合的思路升级。 --- ## 九、关键信息速查 | 项目 | 内容 | |------|------| | 核心算法 | 全采集范围最小二乘串扰系数估计 + 线性减法修正 | | 三种模型 | 单增益 / 全局增益+独立q / 全参数独立 | | 数据范围 | 基线区+生长区+平稳区（全范围，非仅平稳区） | | 优化方法 | 最小二乘（默认）+ L1范数等多种可选 | | 预处理 | 背景相减 + 基线相减 + 异常点去除 | | 适用领域 | PCR、解链曲线、细菌生长、酶动力学、结合过程 | | 硬件要求 | ≥2个光学滤波器/信道 | | 实现载体 | PCR装置内置 / 独立PC系统 / 计算机可读介质 | --- *处理方法：扫描版PDF，pdftoppm渲染150DPI + 逐页视觉分析提取文本，18页说明书完整阅读+核心算法提炼。*

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