流式细胞仪质控流程说明-20170919
来源：/工作相关/液相芯片项目相关工作文档/流式细胞仪项目整理/02软件需求/用户软件需求/质控/流式细胞仪质控需求说明2017-09-19.doc 版本：2017-09-19 文档类型：质控需求说明
一、仪器质控流程
1.1 质控物
- FlowCheck 微球，各通道靶值已知，标定起始电压已知
1.2 单个试管质控流程
- 设置模板：设置 8 个直方图和图上的门模板（门的位置为靶值的 20%）
- 电压调节：正常上样读数，调节电压，每 2 秒将荧光强度中位数与靶值比较
- 不相等 → 继续调节电压
- 相等 → 保存电压值，开始记录数据至 5000 个粒子
- 质控结束：达到 5000 个粒子，保存荧光强度中位数和电压值
- 判定标准：实际测量荧光强度中位数在靶值 ±5% 偏差以内 → 质控通过
二、Calibrite Beads 荧光补偿质控
2.1 质控原理
- 采用 Calibrite Beads，内含 6 种微球
- 1 种未标荧光素的阴性微球 + 5 种标记单色荧光素的单标微球
2.2 上样试管数目（6管）
| 试管 | 组成 |
|---|---|
| 试管1 | 1mL 缓冲液 + 1 滴阴性微球 |
| 试管2 | 1mL 缓冲液 + 1 滴 FITC 单标微球 |
| 试管3 | 1mL 缓冲液 + 1 滴 PE 单标微球 |
| 试管4 | 1mL 缓冲液 + 1 滴 ECD 单标微球 |
| 试管5 | 1mL 缓冲液 + 1 滴 CY5 单标微球 |
| 试管6 | 1mL 缓冲液 + 1 滴 CY7 单标微球 |
2.3 操作步骤
步骤1：准备样品
- 取 6 支干净试管，每支加入 1mL 缓冲液
- 分别加入对应微球，震荡混匀
步骤2：样品上样
- 仪器执行正常开机流程后，6 支试管依次上样
步骤3：调整电压（6 管依次进行）
每管上样时，调整对应通道增益电压使荧光强度落在靶值范围内，记录：
- 该通道增益电压值和荧光强度值
- 其余 4 个荧光通道的荧光强度值
- 对应通道直方图的 CV 值
| 试管 | 主调通道 | 记录主值 | 记录其余通道值 | 查看CV |
|---|---|---|---|---|
| 1（阴性） | FSC | VFSC | VFITC1、VPE1、VECD1、VCY51、VCY71（暗噪声） | FSC |
| 2 | FITC | VFITC2 | VPE2、VECD2、VCY52、VCY72 | FITC |
| 3 | PE | VPE3 | VFITC3、VECD3、VCY53、VCY73 | PE |
| 4 | ECD | VECD4 | VFITC4、VPE4、VCY54、VCY74 | ECD |
| 5 | CY5 | VCY55 | VFITC5、VPE5、VECD5、VCY75 | CY5 |
| 6 | CY7 | VCY76 | VFITC6、VPE6、VECD6、VCY56 | CY7 |
关键数据：每管产生 1 个主值 + 4 个串扰值，共 6×5=30 个荧光强度值，用于补偿矩阵计算
步骤4：绘制质控曲线
- 根据各通道增益电压值和 CV 值，绘制 Levey-Jennings 曲线
- 判定标准：CV 值 ≤ 5%
步骤5：计算荧光补偿矩阵
- 代入试管 1（暗噪声）+ 试管 2~6（各单标荧光强度值）到补偿矩阵计算表格
- 得到最终的 荧光补偿矩阵
三、质控图与报告
- 质控图：各通道的荧光强度靶值 vs 实际测量值
- 质控报告：（文档中未详细展开，待后续补充）
关键数据与判定标准速查
| 质控项 | 判定标准 |
|---|---|
| 仪器质控（FlowCheck） | 荧光强度中位数在靶值 ±5% 以内 |
| 荧光补偿质控（Calibrite Beads） | CV 值 ≤ 5% |
| 电压调节比较周期 | 每 2 秒 |
| 质控粒子数 | 5000 个 |
| 门模板位置 | 靶值的 20% |
| 荧光通道数 | 5 色（FITC/PE/ECD/CY5/CY7）+ FSC |