基于金属/荧光双重免疫标记高通量细胞亚群精准分析装置项目建议
项目概述
本项目拟研制一台基于金属/荧光双重免疫标记的高通量细胞亚群精准分析装置，实现肿瘤及免疫细胞的多参数、多维度大数据信息获取，包括细胞形态、分子标记的空间分布及动态变化、功能特征等。
核心思路：以流式细胞术为基础，结合金属标签免疫标记技术、高通量多光谱显微成像技术、质谱分析技术，在国际上首次提出”荧光同位素双标记高通量细胞亚群精准分析装置”，实现高通量目标细胞筛选、荧光免疫标记结构成像、超分辨免疫质谱分析的多模式”全息”检测。
项目周期：2013.01 - 2016.12（约4年）
立项背景与必要性
科学问题
恶性肿瘤严重危害人类健康。WHO 2012年报告显示，世界每年新发现肿瘤病例1400万，死亡820万；中国发病人数306.5万，约占全球五分之一；死亡人数220.5万，约占全球四分之一。
关键瓶颈：目前还没有任何一种仪器能够同时获得肿瘤或免疫细胞多参数、多维度的大数据信息，包括：
- 细胞形态、分子标记的空间分布及动态变化
- 功能特征等
这些数据对研究肿瘤发病机制、发现细胞新特性、明确患者个体差异和指导治疗意义重大。
肿瘤免疫治疗的研究需求
PD-1抗体技术
PD-1主要在激活的淋巴细胞中高表达，抑制免疫细胞活性，是肿瘤免疫耐受的主要机制之一。通过PD-1抗体可阻断PD-1和PD-L1通路，解除对T细胞的抑制作用。
- 临床试验表明：PD-1抗体能控制50%的黑色素瘤患者癌症进展，治愈约10%的皮肤癌患者
- 需要高通量立体成像流式细胞仪进行T细胞亚克隆的检测及评估
CAR-T技术
CAR-T技术是2014年肿瘤治疗领域最革命性的突破：
- 宾夕法尼亚大学Carl June教授报告：针对CD19的CAR-T技术治疗复发性急性B细胞白血病的完全缓解率达90%
- 需高通量检测改造后T细胞的抗原标记动态变化
- 需明确转染表达蛋白分子的时间、空间变化规律
技术现状与不足
传统流式细胞仪的局限：
- 荧光染料光谱重叠干扰
- 检测参数数量有限（通常<30个）
- 无法获取细胞内信号分子的超分辨信息
CyTOF（质谱流式）的优势与不足：
- 优势：检测通道数可达数十个，无光谱重叠干扰
- 不足：不能获取细胞的功能信息（无荧光/成像信息）
本项目创新：将质谱的”超分辨”标记能力与流式的功能信息获取能力结合，实现”双标签”检测。
装置总体设计
三大功能单元
| 单元名称 | 功能 | 关键指标 |
|---|---|---|
| 细胞流式分析单元 | 高通量细胞免疫标记荧光检测 | 检测通量≥1200个/秒 |
| 细胞分选单元 | 目标细胞筛选 | 分选通量≥600个/秒 |
| 细胞质谱分析单元 | 细胞免疫标记及功能”超分辨分析” | 单次检测参数≥60个 |
核心技术创新点
1. 多激光沿细胞流线立体排布
- 实现多位点荧光标签激发
- 有效避免不同荧光波长间的交叉干扰
- 实现细胞多荧光参数分析
2. 压电射流单细胞分选技术
- 精准施力于单细胞，使细胞偏离既有流线进入分离路径
- 分选速度达到600个/秒
3. 镧系穴状配位物标记试剂
- 可实现时间分辨荧光和ICP-TOF质谱的多模态联合扫描（linked-scan）
- 相对于传统EDTA衍生化配位物，穴状配体具有最高的稀土和其他稳定金属配位螯合稳定性
- 具有高光谱稳定性和化学稳定性
- 金属离子不易泄漏，具有最高的ICP离子化效率
- 无自解离离子质谱背景
技术性能指标
| 指标项 | 指标值 |
|---|---|
| 单细胞免疫标记检测能力 | ≥60参数 |
| 细胞流式分析单元检测通量 | ≥1200个/秒 |
| 细胞分选单元分选通量 | ≥600个/秒 |
| 细胞质谱分析单元检测通量 | ≥600个/秒 |
| 荧光灵敏度(FITC) | ≤200 MESF |
| 荧光灵敏度(PE) | ≤100 MESF |
液流系统设计
系统架构
采用鞘液式液流系统，以注射泵为核心驱动，保证低雷诺数下液流的精确进样和绝对计数。
核心组件：
- 多个注射泵
- 电磁阀、换向阀、卸压阀
- 过滤器、流动室
- 脉动缓冲器、气泡检测模块
- 冲洗缓冲区、进样管、液体池
流动室设计
采用计算流体力学（CFD）方法，多相流VOF模型进行设计：
- 进样区采用非结构四面体网格
- 聚集区采用二维结构化四边形网格
- 形成稳定的核流结构
液流系统技术指标：
- 液流流速：<60 mm/s
- 液流聚焦直径：<20 μm
注射泵设计
样品流注射泵包含4个高精密步进电机：
- 出入口三通控制电机
- 减速比控制电机（2:1高速档 / 44:1低速档）
- 活塞推动电机
- 腔体旋转电机（提高进样稳定性）
细胞分选单元
基于迪恩涡流原理，利用平面MEMS加工工艺实现流体聚焦保持结构，基于压电射流实现细胞分选结构。
MEMS结构原理：
- 圆弧部分：利用鞘液A在Z方向聚焦样品，利用鞘液B在Y方向聚焦样品，保持细胞成单排状态
- 通过细胞荧光及图像数据判断是否为目标细胞
- 控制射流A和射流B将目标细胞偏移进入出口1或出口3
- 非目标细胞进入出口2
软件系统
控制软件流程
- 系统自动清洗
- 系统自检（校准液检测）
- 调节激光功率
- 统计分析（点图/直方图选择细胞群体）
- 数据筛选（文件名、文件夹、细胞群及细胞数）
- 数据获取（.rif和.fcs格式保存）
- 荧光补偿（单阴性样本计算补偿矩阵）
- 统计分析
- 保存实验条件
- 关闭系统（自动清洗）
分析软件
分为向导分析和高级分析两部分：
向导分析：
- 细胞共定位
- 细胞核定位
- 计点操作
- 细胞凋亡检测
- 有丝分裂检测
- 内化和形变特征检测
高级分析：
- 细胞大小检测
- 形态分析
- 结构分析
- 信号强度分析
- 多细胞对比分析
主要合作单位及分工
| 单位 | 负责内容 |
|---|---|
| 中科院苏州医工所（牵头） | 流式细胞仪整机研制、液流系统、电控系统 |
| 中科院长春光机所 | 光学系统设计、多光谱成像、图像处理算法 |
| 中科院微生物研究所（高福团队） | 病毒特异性细胞免疫学研究平台 |
| 中国医学科学院基础所（曹雪涛团队） | 免疫细胞亚群鉴定、肿瘤免疫机制研究 |
| 北京旷博生物技术 | 分子诊断、流式产品、试剂盒研发 |
项目预期成果
主要成果
- 基于荧光同位素双标记高通量细胞亚群精准分析装置1台套
- 细胞表面标志物检测准确性验证结果：淋巴细胞中表达CD3、CD4和CD8阳性细胞百分比符合质控血标称范围
- 配套试剂：研制20种新型金属/荧光双重免疫标记试剂
技术指标验收方案
- 淋巴细胞中CD3、CD4、CD8阳性细胞百分比检测准确率
- 检测通量验证（≥1200个/秒）
- 分选通量验证（≥600个/秒）
- 质谱检测参数数量验证（≥60个）
- 荧光灵敏度验证
应用领域与应用前景
三大应用方向
1. 肿瘤相关免疫细胞亚群的鉴定
通过高通量免疫结构统计分析进行大规模筛选，鉴定与特定肿瘤相关的免疫细胞或特异性新型免疫细胞亚群。
2. 肿瘤相关免疫细胞的分子机制研究
通过高通量细胞成像和软件分析，揭示肿瘤环境下免疫细胞内的精微变化，包括：
- 细胞大小、形态
- 细胞骨架变化
- 胞内分子事件
3. 肿瘤免疫治疗监测和效果评价
通过对肿瘤特异性T细胞记忆分化表型、细胞因子及T细胞活化和抑制性分子表达水平的检测和分析，建立肿瘤免疫治疗效果的评价体系和标准。
临床应用目标
形成以下三类标准/数据库：
- 抗肿瘤T细胞亚克隆鉴定标准
- 肝癌相关免疫细胞亚克隆及亚细胞器数据库
- CTC细胞、血液病细胞新的分类标准（多维参数下）
项目组织管理
管理架构
设立项目监理组、项目研制组和技术指导委员会：
- 项目监理组：负责掌握项目进展情况，监督检查项目负责人履行职责
- 项目研制组：统筹协调资源，负责项目任务的研制（设计、加工、订货、装调、测试、验收）
- 技术指导委员会：由相关领域技术专家组成，对项目实施进行指导和咨询
管理机制
- 任务管理：项目研制组每三个月召开一次技术研讨会
- 质量管理：建立严格的质量控制管理制度，重视关键节点质量监督
- 经费管理：按照项目牵头单位有关经费管理办法审批、核定
- 知识产权管理：设立知识产权专员，负责策划、保护、转移及利益分配
技术风险与应对措施
主要风险
-
技术风险：部分原理和关键技术为首创，无行业标准和规范
- 应对：项目组已有可行性研究结果支撑，风险相对较小
-
经费预算风险：关键部件、材料依赖进口，市场价格波动
- 应对：已完成初步市场调研，希望尽快批准项目以降低风险
-
项目实施周期风险：质谱、显微成像等主体部件加工工艺特殊
- 应对：加强技术协作，派驻人员到加工厂家协调
专利与技术积累
已申请专利（部分）
| 专利号 | 类别 | 名称 |
|---|---|---|
| 201020613651.5 | 实用新型 | 一种流式细胞仪 |
| 201210133808.8 | 发明 | 自动进样装置 |
| 201220247997.7 | 实用新型 | 一种样品盘自动化上样定位控制系统 |
| 201320864975.X | 实用新型 | 一种大动态范围放大电路 |
| 201320522401.4 | 实用新型 | 声光可调谐滤波器级联色散系统 |
| 201320633232.1 | 实用新型 | 一种微粒荧光检测波长即时配置分光系统 |
| 201420060214.3 | 实用新型 | 应用于微弱荧光测量的雪崩二极管APD的高压偏置电路 |
| 201420092446.7 | 实用新型 | 一种小型流式细胞仪液路系统 |
| 201420125350.6 | 实用新型 | 一种流式细胞仪的液流装置 |
| 201410101952.2 | 发明 | 一种流式细胞仪的液流聚焦控制系统 |
| 201530224625.1 | 外观设计 | 流式细胞仪 |
| 201310729200.6 | 发明 | 一种光子计数的校正装置及方法 |
| 201410074073.5 | 发明 | 一种小型流式细胞仪液路系统 |
| 201410103355.3 | 发明 | 一种流式细胞仪的液流装置 |
| 201410046068.3 | 发明 | 应用于微弱荧光测量的雪崩二极管APD的高压偏置电路 |
关联知识
备注
本文件为2017年中国科学院仪器装备研制专项项目建议书，属国自然基金/重大科研仪器类项目申报材料，具有完整的立项依据、技术方案、技术指标、合作单位分工、风险管控等内容，可作为类似项目申请书的结构参考。