PikoReal 荧光定量 PCR 使用培训-致病菌检测
赛默飞（Thermo Fisher）PikoReal 荧光定量 PCR 仪的中文培训讲义（64 页扫描版 PPT），主题是用 PikoReal 做食品致病菌检测。产生背景：QPCR 项目用户软件需求调研参考资料（云盘路径见 frontmatter），对理解 qPCR 软件的典型工作流和验收判据有直接参考价值。
一、qPCR 原理要点（讲义第一部分）
- 普通 PCR 是终点检测：扩增进入平台期后产物量不再反映起始模板量（讲义引用 96 复孔重复扩增曲线作证据），且 EB 染料有毒、操作繁琐、实验室间不可比——这是定量 PCR 存在的根本理由。
- qPCR = 热循环仪 + 实时荧光探测，每轮循环的产物量实时可见，从而精确反推初始模板量。
- 两大检测化学：
- SYBR Green I（非特异染料，结合所有双链 DNA）→ 靠熔解曲线 Tm 值验证特异性（Tm=50% 产物解链温度，一种片段只有一个 Tm，如酵母菌 Tm≈78°C）。
- TaqMan 探针（序列特异，5’报告基团/3’淬灭基团，Taq 酶切后发光）→ 常用染料 FAM/HEX/ROX/CY5。
- 多重能力：单通道（一管一基因，多用 SYBR）→ 双通道 → 多通道（一管 ≥3 基因）。
二、PikoReal 硬件特性（讲义第二部分）
| 部件 | 规格 | 卖点 |
|---|---|---|
| 光源 | 5×LED | 寿命长终身免换；光强稳定到无需 ROX 校正染料 |
| 探测器 | CCD 相机 | 整板同时成像采集多重荧光，高灵敏度 |
| PCR 模块 | 96 孔半导体 | 适合 5-10µl 小反应体系，省成本 |
| 光学通道 | 五通道四色 | 一管最多同时检测 4 种致病菌核酸 |
研发生产中心：芬兰 Espoo。定位：小巧、快速、安静，主打小体系低成本。
三、致病菌检测标准工作流（讲义第三部分，全程约 1 天）
- 样品预增菌：25g/25ml 样品 + 225ml 预增菌培养液，指定温度培养 24h（OXOID 培养基对照表：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 O157:H7、志贺氏菌用 GN/EC Broth 等）
- 细菌裂解（45min）：以金葡菌为例——1ml 培养液 13000rpm 离心 2min → 去上清加 100µl DNA 提取液 → 沸水浴 10min（误差≤1min） → 13000rpm 离心 5min 取上清
- 标准品与反应液配制（30min）：10 倍梯度稀释标准品（5×10⁶→5×10³ 拷贝/ml 四管）；反应液用量公式
(标准品孔数+样品数) ×单板用量 × 110%（多配 10% 补偿损耗；做复孔再乘 2/3）；绝对定量法 5 浓度标准品，阴阳性判定法仅 1 浓度 - 上样：96 孔 Piko 板上样辅助仪，每孔反应液 18µl + 样品 2µl；NTC 孔加 2µl 水
- 编程运行：典型程序 95°C 10min → 40 循环（95°C 15s / 60°C 30-60s 采集）→ 熔解曲线 60-95°C → 20°C hold
- 板布局（Plate Layout）：设样品名/属性/复孔/标准曲线；运行前中后均可改
- 结果分析：绝对定量加标准曲线，R² ≥ 0.98 否则标准曲线作废
四、判定判据（对做 qPCR 软件最有价值的部分）
- ■ Cq ≤ 35：阳性
- ■ 35 < Cq ≤ 40：复测一次，结果重复则判阴性（灰色地带需复检规则）
- 内部对照 IC：Cq ≤ 33 有效；无 Cq 起峰 → 试剂或过程失效（内标全程监控提取+扩增）
- 阳性结果需继续用传统培养法验证；阴性直接出报告——qPCR 把传统 3-5 天检测缩到 1 天内
- 试剂盒开放策略：可选国产/进口多家（达为科、之江生物等），仪器不绑定试剂
五、注意事项（讲义收尾三铁律）
- 样品处理/试剂准备/上样/检测分区操作，严防气溶胶污染
- 加样细心防错漏
- PCR 板放入样品槽对准位置防移位
对项目工作的可行动点
- 做 qPCR 上位机软件需求时，本讲义即天然用例脚本：Protocol 编辑（步骤增删/温度时间/Advanced 升降温速率热盖）、Plate Layout（复孔向导/标准曲线拖拽设置）、Analysis（Cq 阈值判定 + R²≥0.98 校验 + 35<Cq≤40 复检逻辑 + IC 无效报警）是验收核心路径。
- 与 YY-T1173-2010聚合酶链反应分析仪-行业标准要点 互补：讲义给操作流程与经验判据〔注：行标阈值以行标笔记为准，本处仅作关联提示〕。
- 同目录 ELITe InGenius 材料见 ELITe-InGenius操作手册（英文原版 mINT030 en_03）（同类 qPCR 软件标杆）。