知识库

Nikon A1 共聚焦显微镜培训指南-休斯顿大学

11分钟阅读

Nikon A1 共聚焦显微镜培训指南

Nikon A1 / Ti-E Training Guide，为休斯顿大学编制，2015年版。47页完整操作培训，涵盖硬件/软件/共聚焦采集设置/后期图像保存四大模块。共聚焦四大家资料-尼康第4个完成。

一、文档概览

项目内容
设备Nikon A1 共聚焦扫描头 + Ti-E 倒置显微镜
软件NIS-Elements
物镜20x Plan Apo Lambda（干镜，0.75 NA，1mm工作距）+ 100x Plan Apo Lambda OIL（油镜，1.45 NA，0.13mm工作距）
激光器DAPI(405) / FITC(488) / TXRED(561) / Cy5(640) 四线 + DIC透射
扫描模式Galvano（标准成像）+ Resonant（快速成像）
文档结构4大部分：硬件指南(P3-18) / 软件指南(P19-35) / 共聚焦设置(P36-39) / 后期与保存(P40-47)

二、开机顺序（反向关机）

  1. PC 工作站
  2. 电源排插（显微镜/光源）
  3. 共聚焦激光器
  4. 共聚焦控制器
  5. 启动 NIS-Elements 软件
  6. （可选）孵育系统触控板

关机反向执行。

三、显微镜硬件（Ti-E 倒置）

3.1 前面板

  • 显示屏：显示当前Z轴位置，可重置归零
  • 亮度调节旋钮
  • PFS（完美聚焦系统）开关按钮
  • 光路切换旋钮：L100 = 共聚焦，Eye = 目镜观察，默认 1x 放大倍率切换器

3.2 左侧面板

  • Z轴聚焦调节
  • 物镜切换按钮（旋转到下一个物镜）
  • 透射光开关（明场）
  • 透射光亮度变阻器

3.3 右侧面板

  • Z轴聚焦调节
  • Escape（物镜下降，安全保护）/ Refocus（恢复）
    • 注意：Escape 状态下聚焦旋钮被禁用

3.4 顶部滑块（默认全部推入光路）

  • 左侧：D（漫射片）、PFS（完美聚焦）
  • 右侧：NCB（中性色彩平衡）、GIF（绿色干涉，当前空置）

3.5 科勒照明调节（Kohler Alignment）

  1. 用10x物镜，聚光镜置于A位置
  2. 样品对焦
  3. 缩小视场光阑
  4. 调节聚光镜高度至光阑边缘清晰
  5. 调节聚光镜对中螺钉
  6. 打开视场光阑

四、Perfect Focus System（PFS 完美聚焦系统）

原理

  • 870nm LED + 偏移透镜 + 线阵 CCD 闭环检测
  • 不是自动对焦，是焦点维持系统
  • 时间序列成像关键（无需自动对焦）
  • 也支持图像拼接（tiling）和高内涵孔板扫描

注意事项

  • 油镜：样品需在盖玻片上方 3mm 液体内
  • 油镜找到盖玻片顶面，干镜找到盖玻片底面

操作步骤

  1. 通过目镜或监视器对焦样品
  2. 按显微镜前面板 ON 按钮（或软件 TiE pad）启动 PFS
  3. 听到系统啮合声，按钮变常亮绿色
    • 若闪烁：调节聚焦旋钮直到锁定
  4. 系统啮合时图像可能失焦（正常，正在寻找盖玻片），用外部 PFS 偏移控制器重新对焦

安全提示：PFS 运行时，显微镜支架上的聚焦旋钮不起作用。

五、NIS-Elements 软件指南

5.1 基础操作

  • 大多数对话框在 View 选项卡下（Acquisition / Analysis / Visualization Controls）
  • 右键点击空白处也可快速打开
  • 支持标准 Windows 操作习惯

5.2 Z 序列成像（Z-Stack）

  • 设置起止Z位置和步长
  • 推荐步长按 Nyquist 采样计算
  • 可多通道采集

5.3 时间序列成像（Time-lapse）

  • 设置间隔时间和总循环次数
  • 多阶段/多位置可选
  • 配合 PFS 维持焦点

5.4 大图拼接（Scan Large Image / Tiling）

  • 入口：Acquire → Scan Large Image
  • 两种定义扫描范围方式：
    1. X/Y 方向的视野数
    2. 左/上/右/下边界（移动载物台到位置后点箭头图标）
  • 默认 15% 重叠 + Blending 融合拼接
  • 可选自动后处理（拼接缝消除、阴影校正）
  • 支持Z序列或最大强度投影（MIP）拼接
  • 多通道拼接需勾选 multichannel capture
  • 三种焦点维持方式：
    1. PFS（完美聚焦）— 无需额外设置
    2. Focus Surface — 用 XYZ Overview 对话框在样品上画参考点曲面（适用于不平整的整片子）
    3. 传统自动对焦（step by step）— 需预先设置测试

六、共聚焦采集设置

6.1 快速上手 11 步

  1. 目镜下观察并对焦到目标区域
  2. 左侧面板点击 “Confocal” 光学配置加载默认设置
  3. 若互锁显示红色，点击解除
  4. 选择 Galvano（标准）或 Resonant（快速）扫描
  5. 选择激光线（DAPI/FITC/TXRED/CY5/TD（DIC））
    • HV增益：405/640 起始 100，488/561 起始 25
    • Offset：起始 0（背景调节）
    • 激光功率：起始 5%
  6. 扫描尺寸 512×512，扫描速度 1.9μs
  7. 多激光选 “Normal” + “Ch Series”（通道序列，顺序激发）
  8. 针孔设 1.0 AU
  9. 点击 SCAN 开始预览
  10. 调节参数
  11. 点击 CAPTURE 采集

提示：需切回目镜观察时，点击 EYE PORT；再点一次返回共聚焦。

6.2 A1 GUI 界面详解（从上到下）

编号功能说明
1SCAN开始/停止实时预览（预览模式建议不用平均/积分）
2Capture采集图像（使用用户设置）
3Find Mode快速预览扫描模式
4Eye Port切换到上一次非共聚焦设置，再点返回
5AG自动增益，自动设置HV
6Skip跳行扫描，提高速度
7Uni/Bi单向/双向扫描（双向用于活细胞提速，需校准）
8Pixel Dwell / FPS扫描速度（像素驻留时间，单位μs）
9SizeXY 扫描尺寸
10Averaging / Integrating行平均/行积分（仅采集时使用，预览不用）
11Ch Series通道序列：各激光顺序扫描（相近激发荧光团时必须用，减少串色）
12Pinhole针孔大小，1.0 AU 按钮可快速设置
13Optical Path光路设置（激光器/二向色镜/滤光片，仅高级用户）
14Laser Selections激光线选择 + HV增益 + Offset + 激光功率(%)

6.3 Offset 调节要点

  • Offset 值应接近 0
  • 看直方图：每个波长峰值的左侧应接近 (0,0) 原点
  • 正值让峰值右移，负值让峰值左移
  • 此步非常重要，需准确调节

6.4 扫描区域 / 缩放 / 分辨率

  • A1 Scan Area 对话框：View → Acquisition Controls → A1 Scan Area
  • 拖动图像绿色边框可缩放感兴趣区域
  • 共聚焦缩放时像素尺寸减小，图像尺寸不变，分辨率提高
  • Nyquist XY 按钮：自动设置奈奎斯特采样分辨率

七、后处理与图像保存

7.1 比例尺

  • 图像窗口右侧工具栏添加
  • 右键可修改属性或 “burn”（烧入）图像
  • 建议：先保存原图，烧入比例尺后另存副本

7.2 数据可视化方式

  • 2D / Sliced（切片）/ Tiled（拼接）
  • 3D Projection（3D投影）/ EDF（扩展景深）
  • 可生成 3D 旋转动画（.avi 格式）

7.3 Movie Maker（动画制作）

  1. 胶片图标打开 Movie Maker
  2. 点击胶片条进入编辑模式
  3. 设置旋转/移动/调节，在胶片条中添加关键帧
  4. 预览满意后点胶片图标导出 .avi
  • 无压缩
  • 每帧约 150-200ms 通常合适

7.4 快捷键

快捷键功能
X 键截图（用于发表/演示），适用于任何打开的图像窗口、任何方向
Shift + Z全分辨率截图（缩放需在100%），保持原始分辨率或更高

7.5 放大镜工具

  • View → Magnifying glass options
  • 可改缩放倍数、形状、边框
  • 选择区域后按住 Shift 可移动放大镜位置
  • 按住 Shift 时点 X 键可截取放大镜视图

7.6 图像保存决策流程

刚采集到图像 → 用途？
├─ 定量分析（强度测量/面积/细胞计数等）
│   → 保存为 .TIF 或 .JP2（保留原始位深）
│   → 8位分析：Image → Convert → Convert to 8bit RGB
├─ 发表/PS后期处理
│   → View → Visualization Controls → LUTS 调亮度对比度
│   → 保存为 .tif（彩色）
└─ 发给同事/自己电脑快速查看
    → 按 X 键生成压缩 RGB 副本
    → 保存为 .tif

八、与其他尼康 A1 资料的关联

与 A1R 的区别：A1 是标准 Galvano/Resonant 扫描，A1R 是共振扫描高速版本，硬件操作和软件界面大部分通用。

九、关键要点速查

  1. 开机顺序：PC → 电源 → 激光器 → 控制器 → 软件
  2. PFS 不是自动对焦，是焦点维持；油镜找盖玻片顶面，干镜找底面
  3. Ch Series 通道序列：相近激发荧光团必须用顺序扫描减少串色
  4. 针孔标准：1.0 AU
  5. 起始参数：HV 100/25，Offset 0，激光功率 5%，512×512，1.9μs
  6. Nyquist XY 按钮一键设置最佳采样分辨率
  7. 定量保存用 .tif（保留位深），展示用转换后 .tif
  8. X键快速截图发同事，Shift+Z全分辨率截图发表用

关系图谱

反向链接