Leica TCS SP5 共聚焦显微镜简明操作规程
徕卡 Leica TCS SP5 激光扫描共聚焦显微镜（LAS AF 软件平台）的中文简明操作规程，18 页扫描版手册，覆盖开机、明场/荧光观察、光路设置、多维扫描（序列/z 层切/时间序列/波长扫描）、文件管理到关机全流程。对做共聚焦成像、图像采集参数优化的工程与科研场景有直接参考价值。
系统组成与开机
- SP5 系统开关顺序（桌面右侧三个圆形按钮）：PC Microscope → Scanner Power → Laser Power，再把激光开关钥匙（Laser Emission）顺时针旋转 90° 至 On-1，记录开机时间。
- 显微镜电源与荧光电源随后开启；汞灯/EL6000 金属卤化物灯需记录荧光灯使用时间（寿命管理）。
- 软件：LAS AF（Leica Application Suite - Advanced Fluorescence，1.3.1 build 525）；如需快扫系统勾选 “Activate Resonant Scanner”。
物镜与光路
可用物镜：HC PL APO 10x/0.4、20x/0.7、40x/1.25 OIL、63x/1.4 OIL、63x/1.2 WATER、100x/1.4 OIL。
常用激光及波长（表 3-1）：
| 激光 | 波长 |
|---|---|
| 405 Diode | 405 nm |
| Argon | 458, 476, 488, (496), 514 nm |
| HeNe 543 | 543 nm |
| DPSS 561 | 561 nm |
| HeNe 633 | 633 nm |
光路设置要素：激光及输出功率、分光镜、PMT 检测波长范围、PMT gain & offset，系统内置常用荧光染料预设（Load/Save single setting），可调用后优化另存。透射光检测器（PMT Trans）支持 BF、DIC 等观察方法。
扫描模式
- xyz（默认）：xy 扫描 + z 轴层切；另有 xzy、xyt、xyλ、xyzt、xyzλ、xyzλt 等多维组合。
- 序列扫描（Sequential）：多染料防串色，扫描顺序 between lines 适合活细胞。
- 时间序列 xyt：定义 Time Interval（可 Minimize），采集方式三选一：Acquire until stopped / Duration / Frames。
- 波长扫描 xyλ：自发荧光或新染料发射光谱；Band Width 通常 10 nm，波长步进 ≤ 接收带宽；发射谱起点波长应大于激发波长；光谱可经 Process→Tools→Dye Separation→Spectral 存入系统数据库。
关键成像参数原则
扫描参数：format（默认 512x512）、speed（默认 400 Hz 共振扫描线速）、pinhole（默认 1 Airy，增大针孔提高信号但光切变厚）、line/frame average（降噪，线平均较快）、accumulation（仅极弱荧光）、zoom。
Nyquist 采样：正式采图时像素点大小应达到物镜侧向分辨率的一半；物镜分辨率从 Configuration→Objective 读取。推荐参数（表 3-2）：
| 物镜 | NA | 扫描分辨率 | 扫描速度(Hz) | 放大(zoom) |
|---|---|---|---|---|
| 10x | 0.4 | 2048x2048 | 100 | 3 |
| 20x | 0.7 | 1024x1024 | 200 | 5 |
| 40x | 0.85 | 1024x1024 | 200 | 3 |
| 63x | 1.4 | 1024x1024 | 200 | 3 |
PMT 优化法则（GlowOU 判据）：LUT 按钮切换 伪彩/GlowOU/灰度 三档；GlowOU 模式下饱和像素（灰度 255）显蓝、零值像素显绿。调节目标：仅少数像素呈蓝色（饱和），背景呈绿色（PMT offset 调为负值，不超过 0%）。原则：低激光功率 + 高 PMT 电压，保护样品免受光漂白。
多染防串色：强度相当且交叉激发不严重 → 同时扫描 + 压低串色通道 PMT 电压/缩小接收范围；短波长明显强于长波长 → 序列扫描或事后 Dye Separation；严重交叉激发 → 必须 Dye Separation。
文件管理
- 原始格式 .lif（LAS AF 专用，需 LAS AF/LAS AF Lite 打开）；Experiment 树管理 Series。
- Export 输出 TIFF/JPEG（可选合成图或单通道、RAW、时间/长度/λ 标尺）或 AVI 电影（可设 Frame/sec 与压缩）。
- Properties of 可查看/恢复采图参数（Apply Settings），参数可导出 .xml——软件参数溯源的实用设计。
关机
保存图像 → 油镜用无水乙醚:无水乙醇 7:3 或纯乙醇清洁 → 关 LAS AF → 激光钥匙逆时针回 On-0 → 关 Scanner Power → 刻录输出数据（仅允许空白光盘，禁用其他移动存储）→ 关电脑 → 关 PC Microscope → 风扇停转（约 5 分钟）后关 Laser Power，记录关机时间与仪器状况。
工程关联
- 本手册来自共聚焦项目”四大家资料”（奥林巴斯/莱卡/蔡司/尼康），可与 共聚焦SLCM1000产品说明书 等国科均豪自研产品资料对比，理解竞品 LAS AF 的参数交互设计（预设管理、参数随文件持久化、xml 导出）。
- Nyquist 采样与针孔-Airy 单元的取舍，与共聚焦图像采集软件的自动参数推荐逻辑直接相关。
- 关联：CLIP显微镜光学影像软件平台使用说明书