LC/MS/MS 技术与应用
概述
南方医科大学卫生检测中心的 LC/MS/MS 技术培训资料，系统介绍液相色谱-串联质谱技术原理及其在临床检测、法医鉴定、食品安全等领域的应用。
第一部分：质谱基本知识
1.1 质谱的产生
化合物的离子化方式：
- 电子轰击 EI：M + e⁻ → M⁺· + 2e⁻
- 化学电离 CI：M + H⁺ → [MH]⁺
- 电喷雾 ESI：M + H⁺ → [MH]⁺ 或 M + Na⁺ → [MNa]⁺
- 基质辅助激光解吸 MALDI
1.2 质谱图信息
- 质荷比 m/z
- 相对丰度 %
- 化合物分子量信息
- 结构信息（化学指纹图谱）
1.3 质谱仪器类型
| 分类方式 | 类型 |
|---|---|
| 按质量分析器 | 磁质谱、四极杆质谱、飞行时间质谱、离子阱质谱、ICR-MS |
| 按联用方式 | GC/MS、LC/MS、CE/MS |
| 按应用领域 | 同位素质谱、无机质谱、有机质谱 |
1.4 有机质谱关键组成
进样系统 → 接口 → 离子源 → 质量分析器 → 检测器 → 数据系统
第二部分：离子源技术
2.1 电喷雾电离 ESI
- 软电离技术
- 可产生多电荷离子
- 适合大分子（蛋白质、多肽）
- 1984年 J.Fenn 首次发表
2.2 大气压化学电离 APCI
- 适用于弱极性化合物
- 离子化过程：放电针产生试剂离子 → 与样品分子反应
2.3 基质辅助激光解吸 MALDI
- 基质与样品混合
- 激光照射产生离子
- 适合大分子分子量测定
第三部分：质量分析器
3.1 飞行时间 TOF
- 原理：m/z ∝ t²
- 两级加速或反射式提高分辨率
- 量程宽（可达 400,000 m/z）
3.2 四极杆 Q
- 四根平行金属棒
- DC + RF 电压筛选特定 m/z
- 三级四极杆 QQQ 用于串联质谱
3.3 离子阱 IT
- 环形电极 + 端盖电极
- 存储离子、扫描检测
- 可进行多级 MSⁿ
3.4 线性离子阱
- Q1 质量选择
- Q2 碰撞池碎裂
- Q3 线性离子阱扫描
第四部分：LC/MS 接口技术
4.1 接口种类（20余种）
- 直接导入界面
- 传送带界面
- 渗透薄膜界面
- 热喷雾 TSP
- 离子束 PBI
- 大气压电离 API
4.2 LC/MS 联用问题
- 难挥发/热不稳定化合物离子化
- 流速不兼容（LC 1ml/min vs MS 高真空）
- 流动相不兼容（非挥发性缓冲液）
4.3 解决方案
- 使用挥发性流动相
- 柱上液-液萃取
- 双柱相切换
- 微膜离子抑制
- 小内径 LC 柱降低流速
第五部分：LC/MS/MS 应用
5.1 新生儿疾病筛查
可检测 30+ 种遗传性代谢失常疾病：
- 氨基酸代谢失常（PKU、酪氨酸血症等）
- 有机酸代谢失常（甲基丙二酸血症、戊二酸血症等）
- 脂肪酸氧化失常（SCAD、LCAD 缺乏症）
筛查流程：取样 → 甲醇沉淀 → 衍生化 → LC/MS/MS 分析
5.2 药物代谢结合物测定
- 葡萄糖苷酸结合物
- 硫酸盐结合物
5.3 天然产物分析
- 植物组织培养物中 Taxol 分析
5.4 生物技术-分子量测定
- 牛胰岛素 M=5731.68
- 胸腺五肽 M=1209.8
- 生长抑素 M=1638
- 人生长激素 M=22,256.32
5.5 药物合成监测
电喷雾质谱实时监测反应进程，识别中间体和产物。
5.6 司法鉴定应用
检测物质：
- 毒品：甲基苯丙胺（冰毒）、吗啡、K粉（氯胺酮）
- 毒物：鼠药、农药、蛇毒、河豚毒素
- 爆炸物：硝化甘油、RDX、PETN
- 其他：二甘醇、芬氟拉明、西布曲明
5.7 食品安全应用
- 孔雀石绿及其代谢物
- 硝基呋喃类抗生素代谢物
- 氯霉素残留
- 多种抗生素同时检测
- 丙烯酰胺
第六部分：ESI 质谱图解析
6.1 正离子模式
- [M+H]⁺ 准分子离子
- [M+Na]⁺、[M+K]⁺ 金属加合离子
- [M+NH₄]⁺ 铵加合离子
- [2M+H]⁺ 二聚体离子
- [M+H+S]⁺ 溶剂加成离子
6.2 负离子模式
- [M-H]⁻ 去质子离子
- [M+OH]⁻ 氢氧根加合
- [2M-H]⁻ 二聚去质子
- [M+Cl]⁻ 氯离子加合
6.3 多电荷离子
蛋白质可带多个电荷，降低 m/z 便于检测：
- (M+nH)ⁿ⁺ 系列峰
- 通过 deconvolution 计算真实分子量
第七部分：影响因素与优化
7.1 pH 影响
- 正离子检测：酸化样品（pH 比 pKa 低 2 单位）
- 负离子检测：碱化样品（pH 比 pKa 高 2 单位）
7.2 溶剂选择
- ESI 推荐：甲醇、乙腈
- APCI 可选范围更宽
7.3 添加剂
- 常用：甲酸、乙酸、氨水、乙酸铵
- 避免：磷酸、三氟乙酸（抑制电离）
7.4 流速匹配
| 电离方式 | 推荐流速 |
|---|---|
| ESI | 1-1000 μl/min |
| APCI | 400-2000 μl/min |
| 毛细管电泳 | <1 μl/min |
第八部分：样品前处理
8.1 常用方法
- 过滤（0.45μm 膜）
- 溶剂萃取
- 高速离心
- 透析
- 固相萃取 SPE
- 灌注净化
- 色谱分离
8.2 目的
- 防止堵塞进样管道
- 去除不挥发性盐
- 去除表面活性剂
- 浓缩目标物
- 去除基质干扰
第九部分：串联质谱原理
9.1 MS/MS 类型
- 空间串联：双聚焦、QQQ、Q-TOF
- 时间串联：离子阱、FTICR-TOF
9.2 扫描模式
- 子离子扫描：Q1 固定母离子，Q3 扫描碎片
- 母离子扫描：Q1 扫描母离子，Q3 固定碎片
- 中性丢失扫描：Q1 和 Q3 差值固定
- 多反应监测 MRM：Q1 固定母离子，Q3 固定碎片（定量）
9.3 MRM 优势
- 抗化学干扰能力强
- 信噪比高
- 定量准确
- 可同时检测多个目标物
第十部分：蛋白质组学应用
10.1 分子量测定
- 调整 pH 使 m/z 在 500-1800 范围
- 使用已知蛋白校正
10.2 氨基酸序列测定
流程：蛋白酶解 → LC 分离 → MS 检测分子量 → MS/MS 测子离子谱 → 序列分析
10.3 ICAT 同位素标记
- 比较正常与肿瘤组织蛋白表达差异
- 亲和标签纯化含巯基肽段
- MALDI-TOF 或 LC/MS/MS 定量
10.4 磷酸化位点确定
- 中性丢失 H₃PO₄（97.977 Da）
- 负离子检测 PO₃⁻（79 Da）
- 正离子检测酪氨酸磷酸化离子 m/z 216.043
附录：常见化合物质谱参数
甲基苯丙胺（冰毒）
- 分子式：C₁₀H₁₅N，M=149
- MRM：150/119，150/91
K粉（氯胺酮）
- 分子式：C₁₃H₁₆ClNO，M=237
- MRM：238/125，238/220
吗啡
- 分子式：C₁₇H₁₉NO₃，M=285
- MRM：286/165，286/201
氯霉素
- MRM：320.9/151.9，320.9/259.9
硝基呋喃代谢物
- AOZ：LOQ=0.02 ng/mL
- AMOZ：LOQ=0.01 ng/mL
- SEM：LOQ=0.1 ng/mL
- AHD：LOQ=0.02 ng/mL