《蛋白质组实验数据介绍及MaxQuant上机实习》培训讲义
蛋白质组学培训班（内部资料，云盘原件带”请勿外传”水印）的上机实习讲义，分两部分：前半以已发表文献为例讲 iTRAQ 实验数据分析与 fold change 阈值确定，后半是 MaxQuant 软件操作流程。与 定量蛋白质组学培训讲义-方法数据库与MaxQuant应用（同培训班第2讲）和 蛋白质组质谱数据鉴定与质量控制-杨冬培训讲义（第1讲）配套。
一、iTRAQ 差异蛋白阈值确定方法（文献案例）
核心问题：没有生物学重复或重复很少时，差异蛋白的 fold change 卡值怎么定。
案例1：无重复实验（1次 8-plex iTRAQ）
- 参考 J. Proteome Res. 2013, 12, 5096−5109（油棕榈果肉蛋白组）。
- 阈值 <0.769 / >1.3 的依据：Mol Cell Proteomics. 2008, 7(6):1174-85 用 iTRAQ 114/117 标签标记等量蛋白混合物，测得鉴定肽段 ratio 值 SD=0.15，故 1±2SD → 上调 >1.3、下调 <0.77。
- 该文献做法：HY/LY 两组每时间点各 8 例 pool 后标记；ratio 过卡值且至少两个时间点同时过卡值才认定为差异蛋白。
- 经验：control 样本至少一次重复，用其分布定卡值（1±2SD），但无重复时无法做统计检验。
案例2：技术/生物变异量化
- J. Proteome Res. 2007, 6, 821-827（iTRAQ 变异来源分析）：生物学重复取 ±0.50（±50%）卡值可得 88% 定量覆盖；技术重复 ±0.30 覆盖 95%。实验变异与生物变异接近——可测量的偏差主要来自生物变异。有文章引用其 ±0.50 作为 fold change 阈值。
案例3：三次生物学重复
- J. Proteome Res. 2014, 13, 4910−4918：control（siNeg）单独标记测变异，fold change 阈值定为 1.3（control 蛋白 ratio 的 3 倍 SD），同时叠加 t 检验 p>0.05 判据；蛋白必须在 ≥2 次生物学重复中均差异表达才入选（火山图呈现）。
案例4：多次重复（10 次 8-plex iTRAQ，结直肠腺瘤）
- Mol Cell Proteomics. 2014, 13(5):1198-218；60 例样本（30 对 normal vs adenoma），每组实验 113/114 双内参（3N+3A pool），12 fraction × 2 技术重复，共 240 个 raw 文件。共鉴定 4325 蛋白，共定量仅 1072 个。
- 阈值：内参 log2 ratio 分布 95% 在 ±1.4 倍线性范围内；tissue 样本 17% 超出 → 视为差异。
- 统计：多组测量成组 t 检验 + Benjamini–Hochberg FDR 校正，严格卡值 q ≤ 0.02。
- 数据公开于 PRIDE：PXD000445。
- 经验教训：样本对数越多，共定量蛋白越少（overlap 问题），只有共定量蛋白能做后续聚类/PCA/差异筛选；聚类不理想时可按文献做法剔除部分实验数据。
二、MaxQuant 上机实习
免费一体化蛋白质组学工具（搜库+质控+定量+修饰分析），版本 v1.6.0.16，支持 mzXML、wiff 原始文件搜库。官网 coxdocs.org（下载需注册）+ maxquant.org。Windows Vista/7/8/Server 环境；需 MSFileReader 读 Thermo 原始数据、NET Framework 4.5。
操作流程
- 安装配置：安装 MSFileReader；Andromeda Configuration 中加载序列数据库（Configuration → Sequence database → Add → Modify table → Save changes），可自定义修饰和酶切规则。
- 导入数据 + 实验设计：Write template 导出 experimentalDesignTemplate.txt，用 UE/Excel 修改 Fraction/Experiment/Name 后导回（无标定量必须设实验设计）；文件少时可直接界面设置 Fraction + Set experiment。
- 搜库参数：定量方式三选一——Standard（无标/母离子标记）、Reporter ion（子离子标记如 iTRAQ）；无标定量勾选 Label-free quantification (LFQ)。母离子标记最多三重（轻/中/重标）。
- 质控参数：按默认向导设置。
- 定量参数：默认即可——Protein ratio count ≥2，用 Unique+razor 肽段做蛋白定量。
各定量类型的参数要点
- SILAC K6：Variable modifications 里设 K6（Lys）。
- SILAC K8R10 / K4R6 vs K8R10：分别设 K8/R10 或 K4+K8 / R6+R10 组合。
- 8-plex iTRAQ：Reporter ion 模式， reporter 离子 113–121。
- Label-free：LFQ 模式 + 实验设计。
- 磷酸化数据：加 Phospho(STY) 可变修饰演示。
评价
- 优点：免费、流程一体化、适合初学者/常规分析/无 Mascot 等商业软件或无自建流程的生信团队。
- 不足：无中间结果及各步计算输出；只读原始质谱数据，不兼容其他搜库/质控软件结果；不开源、黑箱操作。
可行动点
- 设计低重复 iTRAQ 实验时：至少留一个 control pool 重复，用其 ratio 分布 1±2SD（或按文献 3SD）定卡值，叠加 BH-FDR 校正。
- MaxQuant 定量默认参数（ratio count≥2 + Unique+razor）即为主流推荐，不必调。
- 多批次 iTRAQ 项目要预判 overlap 缩水，规划时控制批次数量。