点扫描成像高分辨率光学显微镜中点扩散函数的研究
肖昀博士学位论文，光学工程专业，导师檀慧明，中科院长春光学精密机械与物理研究所（长光所），中国科学院大学，2015 年 5 月。11 MB PDF，约 157 页正文。该论文位于云盘共聚焦项目”平面反卷积”目录下，是共聚焦/超分辨成像软件项目的理论背景资料，与 xy平面反卷积关键技术方案-共聚焦图像复原算法选型 和 基于盲反卷积的超分辨率图像盲复原算法-元伟2017 构成”硬件光学理论 → 反卷积算法”的知识链。
研究问题
点扫描成像高分辨率光学显微镜（共聚焦、STED）中，点扩散函数（PSF）直接决定系统分辨率。论文目标：建立面向实际系统（多介质、高数值孔径、矢量偏振效应）的 PSF 计算模型，并在自搭 STED 系统上实验验证。
核心工作（六大部分）
- 照明 PSF 模型：推导了一种介质和三种介质（浸没油/盖玻片/样品折射率不匹配）情况下照明点扩散函数的矢量衍射计算表达式，模型同时适用于宽场和点扫描显微镜。分析入射光偏振态、NA、入射介质折射率对照明 PSF 的影响。
- 探测 PSF 模型：同两种介质条件下推导探测 PSF 表达式，结合照明 PSF 建立系统综合成像 PSF 模型；分析探测方式、荧光分子电偶极子方位、针孔大小对探测 PSF 的影响。
- 中空光斑生成：相位调制（圆偏振光 + 0-2π 涡旋相位 / 二维 0/π 相位）与偏振-相位调制（角向偏振光 + 多重 0/π 圆形相位）两种方式生成二维中空光斑；提出三种三维中空光斑生成方法（不同相位调制的两束圆偏振光组合、角向+径向偏振光组合等）。
- STED 系统搭建：关键技术清单——损耗光斑调制、激发/损耗光选择与匹配、两光路精确重合调整、矢量振镜扫描控制、基于 TCSPC 的荧光寿命探测、适于层析成像的三维重建算法。系统五大组成：STED 超分辨成像、荧光寿命探测、控制系统、图像处理、高精度移动定位。
- 实验验证：PSF 测量与仿真一致性验证；角向偏振光聚焦为中空光斑、纳米棒扫描验证径向偏振光斑形状；折射率差越大光斑畸变越大且探测深度越大光斑越大；NA 越大光斑越小。
- STED 超分辨成像结果：激发光 488 nm、损耗光 592 nm @1.9 mW、圆偏振+相位调制（圆偏振度需 >90% 以保证损耗光中心强度低）、48 nm 荧光小球样品。实测 PSF：STED 约 120 nm vs 共聚焦约 240 nm（分辨率提升 2 倍）。再叠加反卷积后处理，信噪比与分辨率进一步提高（原始图中模糊一团的多粒子区域可分辨出大致粒子个数）。
关键结论与工程要点
- 激发光与损耗光偏振态必须相同（同为角向或同为圆偏振），否则受激辐射损耗效率下降；选圆偏振可省掉激发光路的偏振转换和涡旋相位调制，系统更简单——论文据此选圆偏振方案。
- 激发/损耗光束重合需 XY 与 XZ 双平面验证（金粒子扫描成像），不重合时微调损耗光路二色镜。
- 三维超分辨的瓶颈：本文方法纵向分辨率约 105 nm、横向约 45 nm，纵向光斑偏大；改进方向是 4pi 对向物镜（近球形空心光斑）和 ISO-STED 相消干涉。
- G-STED（时间门探测）：损耗区残余自发荧光寿命随损耗功率增强而变短，延迟探测可剔除该背景，降低所需损耗功率、减轻光漂白/光毒害。
- 深层成像像差对策：双光子激发（近红外穿透强）结合 STED，或自适应光学。
与项目知识的关联
- 论文中”STED 图像再做反卷积提高信噪比/分辨率”的实践，直接支撑共聚焦软件项目把反卷积作为标配后处理模块的决策（见 xy平面反卷积关键技术方案-共聚焦图像复原算法选型）。
- 多介质矢量衍射 PSF 模型是”理论 PSF 反卷积”（PSF-based deconvolution）的算法上游：模型输入即实际系统参数（NA、折射率、针孔、波长）。
- TCSPC 荧光寿命探测与三维重建算法章节，可对照 共聚焦LSCM1000产品说明书-苏州医工所自研共聚焦规格基线 的自研整机能力基线。
可行动点
- 若共聚焦软件要做理论 PSF 计算/反卷积核生成，本论文的三介质矢量衍射公式（第 2、3 章）可直接作为实现依据。
- 中空光斑三种三维生成方法对以后升级 STED 模块有参考价值。